聚合度7-15的壳寡糖抑制脂多糖刺激的单核细胞产生TNF-α和IL-8的作用研究

本文通过建立脂多糖刺激的单核细胞炎症损伤模型,观察聚合度7-15的壳寡糖对炎性单核细胞白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响,及对p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)信号通路磷酸化的影响。采用p38信号通路抑制剂(SB203580)验证抑制p38信号通路对脂多糖诱导的单核细胞表达IL-8和TNF-α的作用,从而探索壳寡糖抑制单核细胞炎性损伤的分子机制。结果表明壳寡糖可抑制脂多糖诱导的单核细胞表达IL-8和TNF-α,并且抑制p38信号蛋白的磷酸化水平。因此,初步认为壳寡糖可能通过抑制炎性U937细胞中p38MAPK信号通路抑制IL-8和TNF-α的表达。     

白介素-1 β通过JNK/p38信号-转导通路调控肾系膜细胞表达α-平滑肌肌动蛋白

为探讨细胞内丝裂素原活化蛋白激酶（MAPK）家族各亚类信号转导通路在炎症性细胞因子白介素－1β（IL－1β）对大鼠肾系膜细胞（rMC)表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α－SMA）表达及其分布中的调控作用,以IL－1β（10ng/ml)刺激体外培养的rMC,用电穿孔基因转染及免疫杂交法观察IL－1β对α－SMA基因启动子活性及蛋白表达的作用,并用共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察IL－1β刺激前后细胞内α-SMA及微丝的分布变化。通过应用PD98059和SB203580特异阻断ERK和p38通路、共转染显性失活JNKK基因特异阻断JNK通路,观察阻断对IL－1β刺激所致α-SMA表达或启动子活性的影响。结果显示,IL－1β刺激6h可明显上调α－SMA启动子活性,在1－2d内显著促进其蛋白合成;IL－1β刺激24h后,细胞内α-SMA及微丝在细胞核周的分布增加。阻断ERK通路对IL－1β诱导的α-SMA表达无明显影响;阻断JNK及p38通路均可使IL－1β诱导的α－SMA表达明显受抑;阻断p38通路的作用比阻断JNK通路更强,而且对基础状态的α-SMA表达也有抑制作用。上述结果提示,IL－1β可刺激rMC发生表型转化,其表型标志物α－SMA可通过基因转录增强而增加蛋白表达,在细胞内的分布向核周转位积聚。JNK及p38通路是介导IL－1β刺激rMC α-SMA表达的主要信号转导途径,而ERK通路不影响IL－1β的这一作用。     

多效生长因子通过JNK信号通路负调控Schlafen2基因表达

实验室前期研究发现,多效生长因子（pleiotrophin,PTN）基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞中Schlafen2 (Slfn2)基因高表达.为了探讨Ptn沉默诱导Slfn2基因表达可能涉及的信号通路,应用Western印迹检测外源性PTN因子（终浓度50 ng/μl）对Ptn沉默细胞JNK磷酸化水平的影响;应用Northern 印迹分别检测JNK和p38通路特异性抑制剂对Ptn沉默细胞Slfn2基因转录水平的影响.结果发现,Ptn沉默细胞内JNK磷酸化水平高于对照细胞,外源性PTN处理后沉默细胞内JNK磷酸化水平下调;阻断JNK通路呈时间依赖性抑制Ptn沉默细胞中Slfn2基因转录,阻断p38通路对Ptn沉默细胞中Slfn2转录水平没有明显影响结果提示,Ptn可能通过抑制其下游JNK/MAPK通路来负调控Slfn2的表达.     

低分子量透明质酸寡糖片段介导内皮细胞增殖的信号通路

为研究低分子量透明质酸寡糖片段(hyaluronan oligosaccharides, o-HA)对血管内皮细胞生长与迁移的影响,及透明质酸（hyaluronan,HA）受体（CD44与RHAMM）在此过程中的作用,首先通过细胞计数、MTT实验、细胞周期分布及单层细胞损伤模型修复实验,观察o-HA对血管内皮细胞（猪髂总动脉内皮细胞,porcine vascular endothelial cell line,PIEC）增殖及创伤愈合的影响．结果显示,o-HA明显促进血管内皮细胞生长,并且能够促进内皮细胞向创伤区迁移.蛋白质免疫印迹分析证明,o-HA作用于PIECs后,细胞Src激酶、ERK-1/2的磷酸化程度增强,c-Myc蛋白、周期蛋白D1表达水平增高.Src 激酶特异性的化学抑制剂PP2可轻度抑制ERK-1/2磷酸化;进而通过抗-CD44与抗-RHAMM抗体分别预先封闭细胞表面相应的特异性受体位点后,再用o-HA刺激细胞,探讨HA受体在o-HA介导PIECs信号传导过程中的作用．结果显示,抗CD44抗体不能抑制o-HA介导的ERK-1/2磷酸化;而抗RHAMM抗体可轻度抑制o-HA介导的ERK-1/2磷酸化．结果提示,o-HA具有促进血管内皮细胞增殖及创伤愈合的作用,其机制可能是通过血管内皮细胞表面受体RHAMM实现的.该作用可能通过激活Src激酶及细胞内MAPK（ERK-1/2）信号通路,启动早期反应基因转录,诱使c-Myc蛋白高表达,从而促进血管内皮细胞生长．该作用也可能与上调细胞周期蛋白 D1的表达有关．     

JNK、ERK信号通路在NaAsO_2诱导骨髓间充质干细胞增殖中的作用

目的：研究c-jnk氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）在亚砷酸钠（NaAs02）诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖中的作用。方法：体外培养骨髓间充质干细胞,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测细胞增殖,Western-blot检测磷酸化JNK、ERK表达水平。结果：低浓度1、2μmol/LNaAs02对BMSC有明显的促进增殖作用;高浓度16、32μmol/LNaAs02则对细胞生长产生抑制作用,具有一定剂量-效应关系;2、4、8μmol/LNaAs02处理BMSC24h后,JNK磷酸化表达水平明显增加,ERK磷酸化表达水平明显降低;JNK抑制剂SP600125可明显降低高浓度16、32μmol/LNaAs02的生长抑制作用;ERK抑制剂PD98059可抑制低浓度1、2μmol/LNaAs02对BMSC的促增殖作用。结论：低浓度NaAs02激活ERK信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;高浓度NaAs02激活JNK信号通路,提高细胞凋亡率,可被抑制剂SP600125阻断。NaAs02致癌机制可能与JNK、ERK信号通路作用相关。     

绿脓菌素激活MAPKs、NF-κB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL8表达

采用绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素刺激人呼吸道上皮细胞株A5 4 9和SPC A 1,用ELISA方法检测细胞IL 8分泌水平 ,并使用免疫印迹 (Westernblot)方法观察绿脓菌素对细胞内重要的炎症信号传导途径NF κB及丝裂原激活蛋白激酶 (MAPKs)的激活作用。实验发现 ,绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素可诱导呼吸道上皮细胞株IL 8分泌增加 ,且具有剂量依赖效应。绿脓菌素刺激细胞可使细胞内IκB α发生降解 ,同时使MAPK家族蛋白分子 (ERK1 2、p38、JNK)发生磷酸化。MEK1 2 (ERK1 2激酶 )抑制剂U0 12 6 (10 μmol L)和p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80 (10 μmol L)可降低绿脓菌素诱导A5 4 9细胞IL 8的合成。以上结果显示绿脓菌素通过MAPK信号传导通路增强呼吸道上皮细胞IL 8的表达 ;NF κB通路也参与了绿脓菌素调控细胞IL 8表达的过程     

锌指蛋白Miz1磷酸化对其泛素化作用的影响研究

蛋白的磷酸化与其泛素化作用有着广泛而密切的联系。有研究报道,在DNA损伤的情况下,蛋白激酶Akt能磷酸化转录因子Miz1,参与细胞周期停滞的调节;同时,Miz1因子还可在TNFα诱导下被E3泛素连接酶Mule泛素化而降解,从而解除其对JNK信号通路的阻遏,致使JNK信号通路激活。对鼠源野生型Miz1因子(WT Miz1)的AKT磷酸化保守位点进行定点突变,得到磷酸化的突变因子S419AMiz1,并进行了免疫印记和细胞体内泛素化分析。结果显示:Miz1的磷酸化非但不是其泛素化所必需的因素,反而会对其泛素化起到一定的抑制作用。     

CD 36和胞外信号调节激酶通路在脂多糖诱导炎症因子中的作用研究

本研究以鼠源巨噬细胞RAW264．7为模型,研究CD36和胞外信号调节激酶（ERK ）通路对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞分泌炎症因子的影响。首先用100 ng／ml LPS刺激正常及小干扰RNA （siRNA ）技术沉默CD36表达的巨噬细胞16 h ,检测巨噬细胞的ERK活性及分泌炎症因子如肿瘤坏死因子α（TNF‐α）、白细胞介素6（IL‐6）和IL‐10的水平;继而以20 nmol／L ERK抑制剂处理细胞,再用LPS刺激,检测以上各项指标的变化,进一步明确ERK通路与LPS诱导巨噬细胞分泌炎症因子的相关性。结果显示,经LPS刺激,巨噬细胞的ERK活性显著增强,分泌的促炎因子 TNF‐α和 IL‐6显著增高,抑炎因子 IL‐10水平无明显变化;与CD36正常表达的巨噬细胞相比,CD36表达下降的巨噬细胞ERK活性及促炎因子TNF‐α、IL‐6水平显著下降,抑炎因子IL‐10显著增多。与未处理组相比,ERK抑制剂预处理的巨噬细胞中LPS诱导的ERK活性显著降低,促炎因子 TNF‐α和 IL‐6水平降低,抑炎因子 IL‐10水平升高。结果提示,LPS能通过其受体———CD36,激活巨噬细胞内ERK活性,进而促进巨噬细胞促炎因子的分泌。     

壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响

采用RT-PCR方法研究了不同浓度壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成酶基因的转录调控。结果表明,50μg·mL^-1壳寡糖能够明显诱导烟草悬浮细胞茉莉酸合成途径的关键酶——磷脂酶A2、13-脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶和12-氧-植物二烯酸还原酶基因的表达,而且该浓度的壳寡糖对这些基因的诱导作用相同（似）。在实验设定时间内均诱导表达编码磷脂酶A2的基因,对其它基因的诱导时间均为8小时,表明50μg·mL^-1壳寡糖在诱抗过程中启动了茉莉酸合成途径。而200μg·mL^-1壳寡糖的处理对这些基因的表达无显著影响。表明不同浓度的壳寡糖对烟草悬浮细胞的作用模式存在差异,且高浓度的壳寡糖在烟草悬浮细胞中启动的信号通路可能没有茉莉酸信号的参与。     

转化生长因子β激活性激酶在胶质细胞信号转导中的作用机制

丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和 NFκB介导了炎症细胞转录活性的信号转导过程.转化生长因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1,TAK1）是这些转导通路的上游激酶.通过在胶质细胞株中瞬时转染TAK1和它的结合蛋白因子（TAK1-binding protein1 TAB1）基因,或与iNOS(可诱导型氧化氮合酶基因)启动子报告基因（iNOS-Luc）质粒共转染,探讨中枢两类胶质细胞在炎症反应过程中TAK1诱导iNOS 和细胞因子表达的作用机制.结果显示,TAK1明显激活iNOS 和细胞因子（TNFα、IL-1、IL-6）的表达活性. 而且当使用它的下游激酶p38 MAPK、JNK和NFκB的抑制剂（SB203580、SP620125和CAPE）后,这些表达活性明显被抑制.用IκBα的磷酸化突变体质粒(IκBαM)共转染胶质细胞株,能完全抑制iNOS的表达活性.研究结果提示：在胶质细胞内的p38 MAPK、JNK和NFκB信号介导的iNOS和细胞因子的转录表达过程中,TAK1起着非常重要的调节作用.     

Differential involvement of PKC-dependent MAPKs activation in lipopolysaccharide-induced AP-1 expression in human tracheal smooth muscle cells

Lipopolysaccharide (LPS) has been shown to up-regulate the expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 which contributes to the occurrence of airway inflammatory diseases. Genetic analysis reveals the existence of activator protein-1 (AP-1) binding site on VCAM-1 promoter region. However, the role of AP-1 in LPS-induced VCAM-1 expression in human tracheal smooth muscle cells (HTSMCs) is not known. Here, we show that LPS increased VCAM-1 expression and adhesiveness of HTSMCs through AP-1, since pretreatment with an AP-1 inhibitor tanshinone attenuated LPS-induced VCAM-1 expression and leukocytes adhesion. The implication of AP-1 in LPS-induced VCAM-1 expression was confirmed by animal studies showing that pretreatment of mice with tanshinone attenuated LPS-induced VCAM-1 mRNA expression in airway tissues and accumulation of leukocytes in bronchoalveolar lavage. By using the pharmacological inhibitors and transfection with siRNA of PKC, p42, p38, or JNK2, LPS-induced expression of c-Fos was mediated through protein kinase C (PKC), p42/p44 MAPK and p38 MAPK. While, c-Jun expression was mediated through PKC and mitogen-activated protein kinases (MAPKs, p42/p44 MAPK, p38 MAPK and JNK) in HTSMCs. Pretreatment with the inhibitors of PKCs or MAPKs attenuated LPS-stimulated nuclear translocation and VCAM-1 promoter binding abilities of AP-1, which attenuated promoter activity and gene expression of VCAM-1 and the adhesiveness between HTSMCs and leukocytes. These results indicated that differential regulation of AP-1 through PKCs-dependent MAPKs activation plays central roles in LPS-induced VCAM-1 expression. The altered modulation of this axis with inhibitors or siRNAs may contribute to the improvement of airway inflammatory diseases.     

大黄素对HT-29细胞MAPKs信号通路活化及IL-8分泌的影响

目的：研究大黄素对IFN-和LPS刺激的人结肠癌细胞株HT-29细胞的ERK、JNK和p38MARK和IL-8表达的影响。方法：人结肠癌细胞株HT-29细胞与40ng／mL的IFN．共培养12h,再加入100ng／mLLPS刺激15min,用大黄素预处理进行干预。ELISA检测HT-29细胞内的ERK、JNK和p38MARK含量和细胞上清IL-8含量。结果：IFN-1和LPS刺激后HT-29细胞的ERK、JNK和p38MARK磷酸化水平和IL．8分泌明显升高。大黄素对p38和JNK磷酸化有明显的抑制作用,而对ERK磷酸化则没有明显抑制作用;大黄素能显著降低IFN-γ＋LPS所引起的HT-29细胞IL-8的大量产生,并且呈明显的剂量依赖关系。结论：大黄素能有效抑制IFN-γ＋LPS所引起的HT．29细胞p38和ⅢK的磷酸化,并显著降低IL-8分泌。     

L-精氨酸对脂多糖诱导大鼠肺损伤的保护作用及其机制的研究

目的：观察一氧化氮供体L-精氨酸（L-Arg）对脂多糖诱导大鼠肺损伤炎症反应和核因子-κB（NF-κB）信号通路的影响,探讨L-Arg对肺损伤的保护作用及其机制。方法：健康雄性SD大鼠采用舌下静脉注射脂多糖（LPS）复制肺损伤模型,分别于给予LPS3h和6h后给予生理盐水（对照组及LPS组,ip）和L-Arg（500mg/kgip）（L-Arg治疗组）,治疗3h。每组8只动物。免疫组化染色分析肺组织中NF-κB的核移位;逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测肺组织细胞间粘附分子-1（ICAM-1）基因表达;放射免疫法分别测定肺组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的含量;光镜观察肺组织病理变化。结果：与对照组比较,大鼠肺损伤后NF-κB活化,明显从细胞浆移位于细胞核,表达量也显著增加;ICAM-1基因表达上调;肺组织中TNF-α、IL-6含量明显升高。肺损伤3h用L-Arg治疗3h后,NF-κB从细胞浆向细胞核的移位被明显限制,NF-κB的表达量、肺组织中TNF-α、IL-6含量明显低于相应的LPS组,肺组织病理改变减轻;肺损伤6h用L-Arg治疗3h对LPS引起的以上变化没有明显影响。结论：LPS3h后给予L-Arg可减轻内毒素性肺损伤,抑制核因子的活化,在一定程度上阻断NF-κB相关信号通路的传导,减轻炎症反应是其机制之一。     

胰高血糖素样肽1对脂多糖诱导的血管内皮细胞炎性反应的影响

目的：探讨胰高血糖素样肽1（glucagon like peptide 1,GLP-1）对脂多糖（1ipopolysaccharide,LPS）诱导的血管内皮细胞（VEC）炎性反应的影响。方法：以体外培养的人动脉VEC为研究模型,将细胞分为四组（对照组、LPS刺激组、LPS±GLP-1组、GLP-1组）,Rhodamin-Phalloidin检测肌动蛋白骨架F-actin分布,用苏木素-伊红（HE）染色观察细胞间连接的形态特征,用示踪剂Rhodamine Bisothiocyanate-Dextran检测VECs单层通透性变化改变,酶联免疫吸附实验检测细胞分泌白介素（IL）-6和IL-8的变化。结果：GLP-1（100nM）可减少LPS（1μg／mL）刺激后细胞肌动蛋白骨架F-actin应力纤维的形成,并抑制LPS刺激后细胞间连接的中断。Rhodamine B isothiocyanate-Dextran细胞通透性检测结果显示：GLP-1可明显降低LPS刺激引起的VEC通透性增加[由（2．57±0．19）×10^-5cm／s降至（2．10±0．18）×10^-5cm／s,P〈0．05]。此外,GLP-1可抑制LPS刺激后VEC中炎性细胞因子IL-6和IL-8的表达[分别由（42130±6522）pg／ml降至（27478±5096）pg／ml和（18376±1561）pg／ml降至（14414±927）pg／ml,均P〈0．05]。结论：GLP-1可对抗LPS刺激引起的VEC炎症反应和细胞通透性增加．改善LPS诱导的内皮细胞炎性损伤。     

Upregulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-10 by prostaglandin A1 in mouse peritoneal macrophages

The cyclopentenone prostaglandins (cyPGs) prostaglandin A1 (PGA1) and 15-deoxy-12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) have been reported to exhibit antiinflammatory activity in activated monocytes/macrophages. However, the effects of these two cyPGs on the expression of cytokine genes may differ. In this study, we investigated the mechanism of action of PGA1 in lipopolysaccharide (LPS)-induced expression of interleukin (IL)-10 mRNA in mouse peritoneal macrophages. 15d-PGJ2 inhibited expression of LPSinduced IL-10, whereas PGA1 increased LPS-induced IL-10 expression. This synergistic effect of PGA1 on LPS-induced IL-10 expression reached a maximum as early as 2 h after simultaneous PGA1 and LPS treatment (PGA1/LPS), and did not require new protein synthesis. The synergistic effect of PGA1 was inhibited by GW9662, a specific peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) antagonist, and Bay-11-7082, a NF-kappaB inhibitor. The extracellular signalregulated kinases (ERK) inhibitor PD98059 increased the expression of PGA1/LPS-induced IL-10 mRNA, rather than inhibiting the IL-10 expression. Moreover, PGA1 inhibited LPS-induced ERK phosphorylation. The synergistic effect of PGA1 on LPS-induced IL-10 mRNA and protein production was inhibited by p38 inhibitor PD169316, and PGA1 increased LPS-induced p38 phosphorylation. In the case of stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase (SAPK/JNK), the SAPK/JNK inhibitor SP600125 did not inhibit IL-10 mRNA synthesis but inhibited the production of IL-10 protein remarkably. These results suggest that the synergistic effect of PGA1 on LPS-induced IL-10 expression is NF-kappaB-dependent and mediated by mitogen-activated protein (MAP) kinases, p38, and SAPK/ JNK signaling pathways, and also associated with the PPARgamma pathway. Our data may provide more insight into the diverse mechanisms of PGA1 effects on the expression of cytokine genes.     

LPS-induced IL-6, IL-8, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human lymphatic endothelium.

We have previously reported the TLR4 expression in human intestinal lymphatic vessels. In the study here, microarray analysis showed the expression of the TLR4, MD-2, CD14, MyD88, TIRAP, TRAM, IRAK1, and TRAF6 genes in cultured human neonatal dermal lymphatic microvascular endothelial cells (LEC). The microarray analysis also showed that LEC expressed genes of IL-6, IL-8, VCAM-1, and ICAM-1, and the real-time quantitative PCR analysis showed that mRNA production was increased by lipopolysaccharide (LPS). The LPS-induced IL-6, IL-8, VCAM-1, and ICAM-1 production in LEC was suppressed by the introduction of TLR4-specific small interfering RNA, and also by anti-TLR4, nobiletin, and CAPE pretreatment. These findings suggest that LEC has TLR4-mediated LPS recognition mechanisms that involve at least activation of NF-kappaB, resulting in increased expression of IL-6, IL-8, VCAM-1, and ICAM-1. Both the LPS effect on the gene expression and also the suppression by nobiletin and CAPE pretreatment on the protein production were larger in IL-6 and in VCAM-1 than in IL-8 and in ICAM-1 in LEC. The signal transduction of NF-kappaB and AP-1-dependent pathway may be more critical for the expression of IL-6 and VCAM-1 than that of IL-8 and ICAM-1 in LEC.