人结合珠蛋白cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的：克隆人结合珠蛋白（haptoglobin,Hp）cDNA ,并在大肠杆菌中表达和鉴定。方法：从Hela 细胞中分离总RNA,采用RT-PCR 方法获得人Hp cDNA,分别克隆至原核表达载体pET-32a和PGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21,IPTG 诱导表达,并进行SDS-PAGE 及Western blot 鉴定。结果: 成功构建了高效原核表达质粒PET-32a-Hp 和PGEX-4T1-Hp;Western 印迹结果表明,经IPTG 诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约30 kD和37 kD 的目的蛋白;表达产物经Ni2+-NTA 离子交换树脂纯化, 纯度>90%。结 论：在E.coli成功表达和纯化了人Hp 融合蛋白,为进一步开发人Hp 诊断试剂打下基础。     

Transgenic Tobacco Expressing Pinellia ternata Agglutinin Confers Enhanced Resistance to Aphids

Tobacco leaf discs were transformed with a plasmid, pBIPTA, containing the selectable marker neomycin phosphotransferase gene (nptII) and Pinellia ternata agglutinin gene (pta) via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Thirty-two independent transgenic tobacco plants were regenerated. PCR and Southern blot analyses confirmed that the pta gene had integrated into the plant genome and northern blot analysis revealed transgene expression at various levels in transgenic plants. Genetic analysis confirmed Mendelian segregation of the transgene in T1 progeny. Insect bioassays showed that transgenic plants expressing PTA inhibited significantly the growth of peach potato aphid (Myzus persicae Sulzer). This is the first report that transgenic plants expressing pta confer enhanced resistance to aphids. Our study indicates that the pta gene can be used as a supplement to the snowdrop (Galanthus nivalis) lectin gene (gna) in the control of aphids, a sap-sucking insect pest causing significant yield losses of crops.     

人结合珠蛋白cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的：克隆人结合珠蛋白（haptoglobin,Hp）cDNA,并在大肠杆菌中表达和鉴定。方法：从Hela细胞中分离总RNA,采用RT-PCR方法获得人Hp cDNA,分别克隆至原核表达载体pET-32a和PGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS—PAGE及Western blot鉴定。结果：成功构建了高效原核表达质粒PET-32a-Hp和PGEX-4T1-Hp;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约30kD和37kD的目的蛋白;表达产物经Ni2^＋-NTA离子交换树脂纯化,纯度〉90％。结论：在E．coli成功表达和纯化了人Hp融合蛋白,为进一步开发人Hp诊断试剂打下基础。     

一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达

首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基（GenBank登录号为JF920726）,命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框（516bp）。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a（＋）上,导入BL21（DE3）pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1：6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。     

Molecular cloning and characterization of a mannose-binding lectin gene from <Emphasis Type="Italic">Pinellia cordata</Emphasis>

Using RNA extracted from Pinellia cordata young leaves and primers designed according to the conserved regions of Araceae lectins, the full-length cDNA of Pinellia cordata agglutinin (PCL) was cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length cDNA of pcl was 1,182 bp and contained a 768 bp open reading frame (ORF) encoding a lectin precursor of 256 amino acids. Through comparative analysis of pcl gene and its deduced amino acid sequence with those of other Araceae species, it was found that pcl encoded a precursor lectin with signal peptide. PCL is a mannose-binding lectin with three mannose-binding sites. Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that pcl is expressed in all tested tissues including leaf, stem and bulbil, but with the highest expression in bulbil. PCL protein was successfully expressed in Escherichia coli with the molecular weight expected.     

桃脂氧合酶基因的原核表达分析

利用RT-PCR技术从桃(Prunus persica L.)基因组中克隆到脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因3(PpLOX-3)的ORF全长.ORF全长与原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建重组原核表达载体pET-LOX-3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,通过SDS-PAGE电泳,得到一条约125 kD的融合蛋白条带,除去pET-32a(+)自身诱导的约20 kD大小的蛋白后,结果与PpLOX-3编码的约105 kD蛋白的大小一致.     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

大熊猫FOXL2基因的克隆、序列分析及表达

从大熊猫基因组中克隆了FOXL2基因,并对其进行序列分析及原核表达和真核表达.将FOXL2编码区序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出FOXL2重组蛋白.成功构建了真核表达载体FOXL2-pcDNA3.1/V5-His C,并通过脂质体介导转染HEK293细胞,Western blot检测FOXL2蛋白表达.SDS-PAGE分析表明,FOXL2重组蛋白在诱导4h后表达量达到峰值,其大小约为58.9 kDa,Western blot分析结果显示重组蛋白能够被抗His单克隆抗体特异性识别.FOXL2基因的克隆及其表达为进一步进行FOXL2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。     

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

异源表达的幽门螺杆菌cag4蛋白有溶菌糖基转移酶活性

摘要【目的】构建融合基因原核表达载体pET-28a- cag4,并表达重组融合蛋白cag4,分析重组融合蛋白的酶活性,为新型抗生素（或是抗菌药物）的研发提供作用靶位。【方法】本研究利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a- cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌 BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。【结果】在大肠埃希菌 BL21(DE3)中获得高效表达的重组蛋白; 经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化,并进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析,表明目的蛋白具有明显的肽聚糖水解活性; 通过监测浊度下降速率,比较其在不同pH条件下活性的变化,即?A/（min?mg protein）,结果表明,幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。【结论】幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

OPG-HSP65重组蛋白的原核表达及其生物学活性研究

PCR扩增OPG-HSP65基因,构建原核重组表达载体pET-28a－OPG-HSP65,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行Western blot检测表明,重组蛋白能与抗His-Tag单克隆抗体及鼠抗人OPG单克隆抗体特异性结合。对重组蛋白进行尿素洗涤纯化,进而透析、复性。经破骨细胞生长抑制实验和抑炎实验表明,重组蛋白能减少破骨细胞生成及减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

生物活性肽Lunasin的原核表达和分离纯化

目的：利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法：将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果：①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论：在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。     

Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli

The complete gene xyn// that encodes endo-1,4-beta-xylanase secreted by Aspergillus usamii E001 was cloned and sequenced. The coding region of the gene is separated by only one intron. It encodes 184 amino acid residues of a protein with a calculated molecular weight of 19.8kDa plus a signal peptide of 27 amino acids. The amino acid sequence of the xyn// gene has higher similarity with those of family 11 of glycosyl hydrolases reported from other microorganisms. The mature peptide encoding cDNA was subcloned into pET-28a(+) expression vector. The recombinant plasmid was expressed in Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL, and xylanase activity was measured. The expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and a new specific band with molecular weight of about 20kDa was found when induced by IPTG. Enzyme activity assay verified the recombinant protein as a xylanase. A maximum activity of 49.6Umg(-1) was obtained from cellular extract of E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL harboring pET-28a-xyn//. The xylanase had optimal activity at pH 4.6 and 50 degrees C. This is the first report on the cloning of a xylanase gene from A. usamii.     

大鼠肝脏F抗原基因的克隆、表达及产物纯化

肝脏F抗原是一种新型的能直接反映肝损伤程度的血清学标志,它是1968年由美国学者Fravi从小鼠肝中分离出来的[1].F抗原是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质,相对分子量为43kD[2],正常肝组织中的F抗原含量是血清中的1370倍,只有肝细胞被破坏时,F抗原才释放