果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶（Lcy）基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示：转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明：通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考     

果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶(Lcy)基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因(Pds)启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考。     

番茄E8基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达

利用PCR技术从番茄基因组DNA中克隆长约1.1kb的E8基因启动子与517bp的E8基因片段,将其二者连接构建植物表达载体,导入农杆菌,通过花序侵染法转化拟南芥,得到转基因拟南芥。用RT-PCR分析转基因拟南芥中E8基因启动子驱动E8基因小片段的结果表明,E8基因小片段mRNA仅在转基因拟南芥长角果中转录,根、茎、叶、花中不转录,提示E8基因的1.1kb启动子在异源植物拟南芥中仍具有驱动外源基因果实特异性表达的特性。     

番茄SlWRKY31基因启动子的克隆与逆境应答模式分析

该研究以野生型番茄（Solanum lycopersicum）为材料,采用PCR技术克隆得到了番茄 SlWRKY31 基因起始密码子 ATG 上游启动子序列,并利用该启动子驱动 GUS基因在野生型番茄中表达,对获得的转基因番茄采用不同胁迫处理后进行GUS 染色和定量分析。结果表明：（1）序列分析显示,该启动子全长1 849 bp,含有多个与非生物胁迫和激素响应相关的顺式作用元件,主要包括热胁迫响应元件 HSE、干旱诱导响应元件 MBS、防卫和胁迫响应元件 TC rich repeats、创伤诱导响应元件 WUN motif、脱落酸（ABA）响应元件 ABRE 和水杨酸（SA）响应元件 TCA element。（2）实时荧光定量 PCR 结果显示,SlWRKY31 基因呈组成型表达模式,且在叶和果实中表达量较高,茎中较低;在NaCl、甘露醇、SA、ABA 和42 ℃ 高温的胁迫处理下,其表达量显著升高。（3）构建 SlWRKY31 启动子和 GUS 基因融合的植物表达载体,并通过农杆菌介导法将其转化野生型番茄,对获得的转基因番茄进行 GUS 组织化学染色分析结果显示,SlWRKY31 基因在番茄的各个组织（根、茎、叶、花、果实和种子）中均有表达,表明 SlWRKY31 启动子是组成型表达启动子。（4）对转基因番茄在不同胁迫处理后的 GUS 染色和定量分析显示,SlWRKY31 启动子显著受到NaCl、甘露醇、SA、ABA 和42 ℃ 高温的诱导表达,说明该启动子是一个可以响应多种逆境胁迫的诱导型启动子。     

通过同源重组在聚球藻7002中表达小鼠金属硫蛋白-Ⅰ的初步研究

用PCR方法从海洋单细胞蓝藻聚球藻7002（Synechococcus sp. PCC 7002）基因组DNA中扩增得到藻蓝蛋白β亚基基因（cpcβ）的上游序列（Pcpcβ）,及编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因片段．以Pcpcβ作为启动子、以glnA基因片段作为整合平台,构建含有小鼠金属硫蛋白-Ⅰ（mMT-Ⅰ）cDNA的同源整合表达载体pKGC-MT.通过自然转化法将整合表达载体导入聚球藻7002中,经氨苄青霉素筛选,得到遗传性状稳定的转基因藻.PCR检测证明mMT-Ⅰ基因已整合到蓝藻基因组DNA上;蛋白质印迹表明mMT-Ⅰ已在蓝藻中表达;ELISA结果显示mMT-Ⅰ在蓝藻中的表达量约为800 μg/g.     

花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f启动子的盐胁迫响应元件分析

为研究花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f对盐胁迫响应的分子机制,文中克隆了花生AhRabG3f基因起始密码子上游1 914 bp的启动子片段(3f-P)。将该启动子5''末端截短获得5个片段(3f-P1-3f-P5),长度分别为1 729、1 379、666、510、179 bp。构建了将这6个启动子片段与gus基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS表达分析和酶活性检测,结果表明,在转入各启动子片段的烟草中,都能检测到gus基因的表达,其中全长启动子3f-P的驱动活性最弱,而截短片段3f-P3的驱动活性最强。对转基因烟草进行盐胁迫处理后,3f-P、3f-P1、3f-P2和3f-P3所驱动GUS酶活性是未经盐诱导的3.3、1.2、1.9、1.2倍,表明AhRabG3f启动子是盐诱导型的,在3f-P至3f-P3之间可能存在对盐响应的正调控元件。通过对盐胁迫处理后各启动子片段驱动的GUS活性分析,推测在AhRabG3f启动子上游1 930–1 745 bp、682–526 bp之间存在可能对盐响应的正调控元件MYB、GT1和富含TC的重复序列,1 395–682 bp之间存在可能对盐响应的负调控元件MYC。研究结果可为利用诱导型启动子调控花生的耐盐性提供指导。     

中国水仙LAR基因启动子的克隆及功能初步分析

为了解NtLAR基因的表达调控机制,该研究以中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)‘金盏银台’ DNA为模版,采用染色体步移法克隆了NtLAR基因起始密码子ATG上游启动子片段序列,测序结果显示,该克隆片段共995 bp(GenBank登录号：MH371155)。通过PlantCare数据库对获得的启动子序列顺式作用元件预测发现,NtLAR启动子序列中包含有大量顺式作用元件,如光反应元件ACE、G box、GATA motif、GT1 motif,激素响应元件CGTCA motif、ABRE、TGACG motif、TGA element,胁迫响应元件和MYB 结合位点 MBS等。成功构建了植物表达载体pBI121 pNtLAR∷GUS和pGreenII 0800 pNtLAR Luc。pBI121 pNtLAR∷GUS在烟草叶片的瞬时表达结果显示,克隆的启动子片段具有活性;pBI121 pNtLAR∷GUS在水仙不同组织器官的瞬时表达实验发现,NtLAR基因的表达具有组织特异型,其在鳞茎盘的表达量较高,在花瓣和副冠中的表达量较低;将pBI121 pNtLAR∷GUS分别和中国水仙R2R3 MYB转录因子NtMYB2、NtMYB5混合注射烟草叶片,GUS染色结果显示NtMYB2和NtMYB5并不能抑制NtLAR启动子的活性,定量PCR结果与GUS染色结果一致。采用pGreenII 0800 pNtLAR Luc载体进行双荧光素酶实验进一步验证了GUS染色实验和定量PCR结果。     

水稻OsWRKY89启动子紫外线-B反应元件区的鉴定

植物需要利用太阳光能进行光合作用,因而不可避免地受到紫外线-B(UV-B) 辐射的影响．为了鉴定水稻WRKY转 录因子OsWRKY89基因启动子中的UV-B反应相关元件,分析了转启动子不同缺失片段与gus融合基因的水稻幼苗,发现在该启动子中存在UV-B反应元件,位于基因翻译起始位点上游-1 213～-1 188之间的25 bp区域,碱基序列为AAGATCTACCATTGCTCTATAGCTT．结合OsWRKY89和UV-B诱导上调表达基因启动子序列分析发现,该元件区在水稻UV-B反应基因启动子上具有高度的保守性,而且与已知保守的光反应元件位置邻近,表明该区域在水稻UV-B反应的转录调控中可能具有重要功能．     

香蕉果实成熟相关基因ACO1启动子区的克隆及其功能初探

根据已报道的香蕉果实表达ACC氧化酶基因(ACO1)的序列,用改进的接头连接PCR法从香蕉基因组中扩增并克隆了此基因5′旁侧区1526bp的片段。其中包含一个推测的TATA盒序列;与已公布的两个香蕉ACC氧化酶基因启动子序列(分别为934bp和1451bp)的相似性各为97.3%(López-Gómez等)和88.8%(May和Kipp)。将4个含有不同大小启动子区的克隆片段与GUS基因编码区连接构建成嵌合基因,通过基因枪轰击转入香蕉叶、根和果实的细胞后。瞬时表达结果表明不同大小的ACO1-启动子区段都只在果实细胞中指导GUS基因表达,证明该启动子具有指导基因在果实中表达的功能;并推测负责果实特异性的顺式元件可能位于启动子近端0.7kb区段之内,在468至822 的355bp区段内可能存在与正控制有关的顺式元件。     

西瓜果实特异启动子WSP功能区域的初步定位

西瓜AGPase 的大亚基基因wml1的 5′端上游1573bp序列,是一个果实特异性启动子(命名为WSP)。根据WSP内部酶切位点,获得了3个不同5′端缺失的启动子片段（长分别为 1201bp、898bp、795bp）,并构建成植物瞬间表达载体,与含WSP的瞬间表达载体一起用基因枪的方法转入西瓜叶、茎、花及不同发育期果实中。瞬时表达结果表明,1573bp 、1201bp 、898bp的片段均能指导GUS基因在西瓜果实和花中特异性表达,但是表达强度和表达时期有所不同,795bp的片段不能指导GUS基因表达。推测在180bp-551bp之间可能存在促进外源基因在果实发育后期表达的顺式作用元件,而果实特异调控区域可能位于854bp-957bp之间。