哺乳动物精原干细胞的操作技术及应用

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)具有高度的自我更新能力和分化潜能。精原干细胞移植技术作为精原干细胞研究的重要手段,已成为一种新兴的动物繁殖技术,能够提高雄性动物的生殖能力。该技术是从适龄雄性供体动物中采集精原干细胞,注射入受体动物的生精小管中使其产生精子。通过对精原干细胞的体外培养、遗传修饰及移植等操作,可以为探讨精子的发生机制、重建不育个体的精子发生、生产转基因动物提供新的途径;同时为提高优良品种家畜的生产效率、保护野生动物资源及不育症的治疗提供了一种新的方法;在医学、生物学及动物科学方面有着广泛地应用。通过对培养体系的不断完善,筛选、移植方法的不断改进,可获得更高的移植成功率。本文将从利用精原干细胞法生产转基因动物的优势,精原干细胞的形态特性和增殖分化特性,精原干细胞的移植技术和影响移植效率的关键因素,精原干细胞的体外培养,以及相关操作技术的应用与前景展望等方面做一概述。     

精原干细胞途径制作转基因动物

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCS)具自我更新并分化出大量精子的能力.通过其建立转基因动物模型,对研究精子的发生机制、生产转基因动物、重建不育个体的生精功能等都有着.显著的推动作用.从研究意义着手,分述了精原干细胞途径制作转基因动物各技术步骤的研究情况,并提出了运用克隆技术丰富该途径的新思路.     

精原干细胞介导的基因编辑动物模型研究进展

合适的动物模型对于人类疾病的研究和药物开发至关重要。精原干细胞是位于睾丸组织曲细精管基底膜上的一类具有自我更新和分化潜能的成体干细胞,可以定向分化产生精子。利用精原干细胞作为基因编辑的对象,生产基因编辑的精子进行受精有望成为建立基因编辑动物疾病模型的一条有效途径。该文就精原干细胞的生物学特征、体外培养以及精原干细胞介导的基因编辑动物模型的进展和优缺点进行了阐述。     

浅谈精原干细胞研究进展

精原干细胞是雄性动物体内精子发生过程中起重要作用的精原细胞类型,不但具有干细胞特性,还能定向分化为雄性配子将自身基因传递给后代。除此之外,体外培养和鉴定精原干细胞为移植和转基因提供了基础。我们对精原干细胞的生物学特性、分离培养、鉴定、移植及精原干细胞介导的转基因进行简要概述。     

精原干细胞的生命历程

精原干细胞是动物体内的一种成体干细胞,在睾丸微环境中可以像胚胎干细胞一样具有增殖、分化潜能。近年来借助于各种细胞学技术,人们对精原干细胞在不同睾丸微环境中的分化和发育状况进行了深入研究,睾丸内不同种类细胞间的相互作用以及特定微环境对干细胞转分化的影响,已成为本领域的热点核心内容。将从精原干细胞生命历程的角度讨论该过程中所取得的研究成果和存在的问题。     

精原干细胞niche的研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是指睾丸内位于曲精细管基膜上既能自我更新维持自身适量恒定,又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞。随着干细胞深入的研究,人们发现了一种控制着干细胞可塑性与命运的微环境,此微环境被称为干细胞niche,干细胞niche由niche细胞、细胞外基质、细胞因子等构成。精原干细胞niche是由黏附因子、生长因子、支持细胞、间质细胞以及小管周肌肉细胞组成。大量的研究表明支持细胞在睾丸中是主要的成体细胞,通过分泌可溶性的因子来影响精原干细胞niche的结构与功能,同时支持细胞还能够间接的影响其他的成体细胞。随着年龄的增长使得精原干细胞niche的功能下降。精原干细胞数量以及精原干细胞niche为我们研究组织特异性干细胞生物学以及保持再生组织平衡提供了很宝贵的线索,精原干细胞对于保持组织的自我更新具有很重要的作用,并且受到人们大量的关注,然而精原干细胞niche也起到很重要的作用,它为治疗一些疾病提供新途径.本文将综述精原干细胞niche及其变化对精原干细胞功能调节的相关研究进展。     

精原干细胞移植研究进展

精子发生 (ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ)是一个特殊的细胞分化过程。在这一过程中 ,精原干细胞 (ｓｐｅｒ ｍａｔｏｇｏｎｉａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ)经过增殖分化形成具有特殊形态的精子。由于精子发生是在一个特定的环境中进行 ,缺乏体内外的研究模型 ,阻碍了这一领域的进展。 1994年开始的精原干细胞移植技术近几年取得了较大进展 ,已成为研究精子发生机理的重要模型。而且这一技术为治疗一些类型的雄性不育、保存某些需要化疗的癌症患者的生育能力以及转基因牲畜生产开辟了新的途径。本文全面综述精原干细胞移植的发展过程、最新进展和…     

哺乳动物精原干细胞的研究进展

精原干细胞是雄性体内可以永久维持的成体干细胞,它具有自我更新和分化的能力,保证了雄性个体生命过程中精子发生的持续进行,从而实现将遗传信息传递给下一代。精原千细胞不仅可在体外实现长期培养或诱导分化为各级生精细胞,并且可在特定条件下将其诱导去分化成为多能性干细胞。同样,这种多能性干细胞如同胚胎干细胞,可被诱导形成造血细胞、神经元细胞、肌细胞等多种类型细胞。鉴于其独具的生物学特性,精原干细胞在揭示精子的发生机制、治疗雄性不育和转基因动物等研究中具有重要价值。该文对精原干细胞在生物学特性、纯化培养、移植、体外诱导分化及其相关调控方面的各项研究进行了小结,综述了近年来的研究历程和最新研究成果。     

RBFOX2缺失抑制雄性小鼠的减数分裂起始

减数分裂起始是配子发生的关键步骤。目前人们已经发现了一些减数分裂起始所必需的基因,但是对于该过程的调控基因及其作用机制还知之甚少。本实验室先前建立了精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）体外培养以及体外诱导减数分裂起始的技术体系,为更好地探究减数分裂起始调控基因及作用机理提供了良好的条件。实验室前期研究发现RNA结合蛋白RBFOX2可能调控减数分裂起始,然而RBFOX2在生殖细胞的减数分裂起始过程中的功能及作用机制还需深入研究。本研究利用慢病毒介导的转基因技术产生了RBFOX2敲降的精原干细胞系;发现RBFOX2敲降后,精原干细胞的自我更新、增殖以及分化未发生显著变化,但是减数分裂无法启动,分化型精原细胞发生明显凋亡。这一结果进一步显示了RNA结合蛋白在雄性动物减数分裂起始中的重要功能。     

睾丸组织块和精原干细胞异种移植的发展及现状

精原干细胞是精子发生的前提和基础,精原干细胞的存在为男性保存和恢复生育能力提供了可能.精原干细胞和睾丸组织移植技术已经被用来研究生精细胞的增殖与分化,这项技术对恢复无精子症或睾丸肿瘤患者的生育能力等有着重要的应用前景.综述了睾丸组织块和精原干细胞的移植技术的发展、现状及在医学领域的应用前景.     

精原干细胞移植的临床应用前景

精原干细胞(ssc)是哺乳动物成体睾丸生精上皮中唯一可复制的多能二倍体细胞,它能向子代传递遗传信息.随着体外培养、冷冻保存技术的发展,精原干细胞及其移植(SSCT)技术在临床应用方面越来越显示出重要的应用前景.本文对精原干细胞的生物学特征,移植技术及其在医学领域的应用前景进行展望.     

不同年龄小鼠精原干细胞系的建立

精原干细胞（spennatogonial stem cells,SSCs）是雄性动物体内能进行终生自我更新并能将亲代基因遗传给予子代的一类细胞。不同年龄段的小鼠有不同的建系方法。6-7d幼鼠,可以用差异贴壁或直接贴壁法;5-6周成年鼠,一般采用差异贴壁法;31周老年鼠,最好种于饲养层细胞上。通过对精原干细胞系的甲基化和特异基因分析以及睾丸体内移植验证分析,成功建立了具有功能的不同年龄段的小鼠精原干细胞系。     

精原干细胞移植及受体制备技术研究进展

精原干细胞移植为研究精子发生、雄性生殖能力及新型转基因技术奠定了基础.尽管已利用小鼠建立了较成熟的移植技术体系,白消安受体制备法和曲细精管及睾丸网移植法已得到广泛应用,但白消安可导致动物较高的死亡率,局部射线照射和无内源性精子发生受体动物的制备费用较昂贵,热处理受体制备法应用范围较窄且效果不稳定;三种移植方法均对操作有较高的技术要求,曲细精管、睾丸输出管移植需要显微注射装置,而睾丸网移植需要超声仪的辅助.而且,移植效果在不同实验间、物种间差异较大,移植效率有待提高,对移植排斥反应的认识也有待进一步深入.对睾丸结构和精原干细胞生物学特性的深入研究,将有助于建立更简单高效的受体制备和移植的方法.     

小鼠精原干细胞冻存后体外培养

目的:研究冷冻后精原干细胞体外培养时的生物学行为.方法:体外培养冻存后的6日龄小鼠生精上皮细胞,并利用碱性磷酸酶活性及细胞形态,检测其中的精原干细胞.结果:当有BRL饲养层时,冻存后的精原细胞在贴壁、存活及增殖等生物学行为方面与新分离的精原细胞均无明显不同.培养25～30 d,培养体系中仍保留有少量精原干细胞及其最初几代分化细胞.结论:冷冻保存后的精原干细胞能在BRL细胞饲养层上正常地贴壁、生长和分裂.     

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。     

小鼠精原干细胞与胚胎干细胞样细胞

近年来,通过培养小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)获得了胚胎干细胞样细胞(,embryonic stem cell-like cells,ES样细胞).这些研究表明小鼠精原干细胞不仅具备特异分化为精子的干细胞潜能,而且具备胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)分化为三胚层的多向分化潜能.因此.这将有助于研究干细胞的分化调控机制,并且这些研究成果延伸至人类精原干细胞,也将为再生医学获取特殊的胚胎干细胞样细胞或特异分化的精子细胞开辟了蹊径.     

精原干细胞与睾丸生殖衰老的研究进展

雄性睾丸内精子的生成及其质量随年龄增长逐渐降低。精原干细胞是精子生成的起点,其数量和质量决定了精子的生成,而精原干细胞niche是调节精原干细胞自我更新与分化的重要因素。在衰老过程中,干细胞微环境退化,精原干细胞自我更新和分化失衡,被认为是衰老导致睾丸生殖功能衰退的的主要因素。本文将综述衰老引起的精原干细胞与niche变化及其对生殖的影响相关研究进展。     

小鼠雄性生殖干细胞转录组分析揭示成熟精原干细胞特征

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是成年动物睾丸中的成体干细胞,具有自我更新与分化的能力。小鼠(Mus musculus)精原干细胞来源于胚胎期的原始生殖细胞(primodial germ cells, PGCs),小鼠出生前原始生殖细胞处于有丝分裂静止状态,出生后恢复增殖并由曲细精管中央迁移至管壁基质,建立稳定的精原干细胞克隆。成熟小鼠的精原干细胞周期性地启动精子发生以维持雄性动物长期稳定的生殖能力。精原干细胞在其建立和成熟后是否具有特征上的差异目前尚不清楚。本研究在前期建立的不同年龄小鼠精原干细胞(表达多能性基因Pou5f1编码的OCT4)转录组数据基础上,对小鼠新生期(出生后3天)、幼年期(出生后7天)和成熟期(2～3月龄)精原干细胞的基因表达差异进行了生物信息学分析,包括差异表达基因(differentially expression genes,DEGs)的筛选、DEGs编码的蛋白相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)的建立、功能聚类富集(Gene Ontology,GO)和通路分析(Kyoto...     

大鼠精原干细胞的高效分离和纯化方法

精原干细胞是精子发生的基础,是永久分化成精子的克隆源,它既可以自我更新维持体内干细胞的数量,又可以增殖分化形成各阶段的生精细胞直至成熟精子。本文以22～25日龄Wistar-Iamichi大鼠为研究对象,利用两步酶消化法分离得到睾丸曲细精管细胞悬液,根据精原干细胞与曲细精管细胞悬液中体细胞(支持细胞及少量的管周细胞)及各级分化的生精细胞贴壁能力及对细胞外基质粘附力的不同,将大鼠精原干细胞进行纯化。经纯化后,5只大鼠的睾丸可以得到约3×10~5个精原干细胞,该精原干细胞在体外培养可形成克隆,并且该克隆可表达精原干细胞特异的标记基因GFRα1和CDH1。本文所介绍的高效分离和纯化大鼠精原干细胞的方法,操作简便,且得到的精原干细胞具有很高的活力和增殖能力,该方法为今后大鼠精原干细胞的长期培养及操作研究奠定了基础。     

红鳍东方鲀精原干细胞鉴定、分离及纯化

为获得高比例精原干细胞, 开展了不同月龄红鳍东方鲀精原干细胞分离纯化研究。采用组合酶消化法制备不同月龄的精巢单细胞悬液, 通过形态学观察和生殖细胞特异基因vasa免疫荧光鉴别精原干细胞, Percoll不连续梯度(10%、30%和50%)纯化精原干细胞。结果显示: 14月龄雄鱼精巢生殖细胞主要为A型精原细胞, 精原干细胞占比极显著性地高于22月龄(P<0.05)。纯化后精原干细胞主要分布在10%—30% Percoll梯度带中, 14月龄雄鱼生殖细胞主要分布在此层, 且纯化后精原干细胞占比远高于纯化前以及22月龄纯化前后。结果表明, 14月龄更适用组合酶消化分离, 并通过Percoll梯度离心法获得高比例的红鳍东方鲀精原干细胞。