植酸酶及其基因工程研究进展

植酸酶可添加于食品与饲料中,能消除因不能降解的植酸所引起的抗营养作用,提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率,降低粪便中磷的含量,从而减少环境中磷的积累污染,有利于保护生态环境。弄清植酸酶的性质、基因结构和功能,了解其基因工程的研究进展,不仅具有重要的理论意义,而且在开发研究植酸酶制剂用于饲料、食品和医药等方面具有重要的实践价值。本文谨对植酸酶的性质、基因结构和功能及其基因工程的研究进展做一综述,并探讨了植酸酶的应用前景。     

植酸酶的研究与应用进展

综述了植酸酶的生物学特性 ,产植酸酶的菌种来源 ,以及通过诱变和基因工程对菌种的选育 ,并阐述了植酸酶在饲料中的应用     

植酸酶的分子生物学与基因工程

植酸酶是一种新型的、可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂,它对提高饲料中磷的利用率,提高动物的生产性能,以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水域的磷污染有着重要意义。本文综述了植酸酶的分子生物学及基因工程研究的最新进展,讨论了其进一步的研究发展方向。     

植酸酶的研究进展

从三个方面综述了植酸酶的研究进展：（1）植酸酶的种类及来源;（2）植酸酶的性质;（3）植酸酶基因及基因工程。     

转基因植物表达植酸酶研究进展

植酸是植物体内磷的主要存在形式,其绝大部分不能被单胃动物消化吸收,而随粪便排出体外造成环境污染;同时,植酸又是一种抗营养因子,它通过络合植物体内的一些营养成分而降低植物的营养价值。通过植物转基因方法使植物自身表达足量的植酸酶,以减小植酸带来的不利影响,是提高植物性饲料营养价值和控制环境磷污染的一种经济有效的措施。就转基因植物植酸酶的优势、研究现状、存在的问题及其发展前景进行了综述。     

芽孢杆菌植酸酶分子生物学研究进展

来源于芽孢杆菌的中性植酸酶具有良好的热稳定性,适合作为消化道呈中性鲤科鱼类的饲料添加剂。该植酸酶晶体具有独特的螺旋桨样空间结构,钙离子在其稳定性和催化活性的结构功能关系中具有重要作用,并表现出特有的催化机理。该基因与已知植酸酶基因的结构有所不同,是一种新的植酸酶。目前主要采用多种原核表达系统对其进行表达。比较表明,芽孢杆菌表达系统和酵母表达系统是实现芽孢杆菌植酸酶规模化生产的有效途径。     

基因工程酵母产植酸酶的酶学性质研究*

对重组基因工程酵母（PP-NP-1）进行诱导培养,然后对诱导表达物进行饱和硫酸铵分级沉淀,再对沉淀进行Western印迹,证实其为特异的植酸酶,再对基因工程菌所产植酸酶进行纯化,并对其酶学性质进行了研究,研究结果,测得其分子量为70.2kD;酶作用最适温度为55℃;在pH2.5-5.6范围内植酸酶均具较高的酶活性,最适pH为4.6,另外Ca^2 ,牛血清白蛋白,Mn^2 ,Mg^2 对酶有激活作用,而HPO4^2-,SDS,Cu^2 ,Fe^2 对酶有抑制作用。     

植酸酶及其植物基因工程

综述了植酸酶的来源、其酶学性质及植酸酶的植物摹因工程,并对其存在的问题、应用前景作了展望。     

植酸酶基因工程菌构建及其生产应用中问题分析

简要分析了植酸酶的生物学特性以及构建植酸酶基因工程菌和酶生产应用中存在的问题,提出了对植酸酶基因的重组改造、载体表达宿主筛选的方法和途径,以求构建高效表达、高活性和高稳定性的酶基因工程菌,促进酶的生产和应用。     

根霉植酸酶的研究──Ⅰ.菌株的分离筛选及发酵条件研究

从21个土样和15株产酶菌株中筛选到1株产酶能力较强的菌株——根霉（Rhizopussp.）MR020。其优化培养基组成（％）：大米粉2.0,干酪素0．05,（NH4）2SO41.0,MgSO4·7H2O0.05,FeSO4·7H2O0.01,pH5.0。其振荡培养条件：培养基装最25ml／250ml三角瓶,用培养8天、浓度为1×107个／ml的孢子悬液接种1ml,于30℃,150r／min振荡培养108h产酶量最高达4000u/ml。     

Phytase activity in Cryptococcus laurentii ABO 510

Ten Cryptococcus strains were screened for phytase activity, of which the Cryptococcus laurentii ABO 510 strain showed the highest level of activity. The cell wall-associated enzyme displayed temperature and pH optima of 62 degrees C and 5.0, respectively. The enzyme was thermostable at 70 degrees C, with a loss of 40% of its original activity after 3 h. The enzyme was active on a broad range of substrates, including ATP, D-glucose 6-phosphate, D-fructose 1,6-diphosphate and p-nitrophenyl phosphate (p-NPP), but its preferred substrate was phytic acid (K(m) of 21 microM). The enzyme activity was completely inhibited by 0.5 mM inorganic phosphate or 5 mM phytic acid, and moderately inhibited in the presence of Hg(2+), Zn(2+), Cd(2+) and Ca(2+). These characteristics suggest that the Cry. laurentii ABO 510 phytase may be considered for application as an animal feed additive to assist in the hydrolysis of phytate complexes to improve the bioavailability of phosphorus in plant feedstuff.     

Phytase enzymology, applications, and biotechnology

Phytases are phosphohydrolases that initiate the step-wise removal of phosphate from phytate. These enzymes have been widely used in animal feeding to improve phosphorus nutrition and to reduce phosphorus pollution of animal waste. The potential of phytases in improving human nutrition of essential trace minerals in plant-derived foods is being explored. This review covers the basic biochemistry and application of phytases, and emphasizes the emerging biotechnology used for developing new effective phytases with improved properties.     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过ＰＣＲ的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,ＤＮＡ全序列分析表明其结构基因全长１１５２个核苷酸（编码３８３个氨基酸）,５′端有一编码２６个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌ＩＰＴＧ诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的４０％以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的基因有正常的生物学功能。     

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18-T载体中。以此片段构建了pPIC9K-phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G418抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS-PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 39583u mL发酵液 (PP N1422 )和14 89083u/mL发酵液 (PP-N1444)的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (422u/mL)的 34113倍和 35286倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2.5～3.0和 5.0～5.5时酶活性最高 ,且在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为55℃。     

植酸酶基因在家蚕—杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillusniger 96 3克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫 -杆状病毒表达系统中表达 ,SDS PAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到 1.4 3g L血淋巴液和 1.90g L血淋巴液。酶活性测定结果表明 ,在蚕体和蛹的表达活性分别为 4 .6 7× 10 8u L血淋巴液和 5 .99× 10 8u L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为 5 0～6 0℃ ,最适pH值为 5 .5～ 5 .0和 2 .5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性 ,可以用于生产饲用植酸酶。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。