表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究.我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal.p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株.接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的galB16肿瘤模型.并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制galB16肿瘤生长的作用.     

表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究。我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal。p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的gal B16细胞株。接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型。并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制gal B16肿瘤生长的作用。     

PARP酶抑制剂未引起整合的外源LacZ基因的丢失

使用聚ADP核糖聚合酶（PARP）NAD位点抑制剂苯甲酞胺（BA）研究了降低PARP酶活性对外源LacZ基因整合稳定性的影响．利用DNA体外重组技术将LacZ基因全序列插入到真核表达载体pSV2neo的HindⅢ位点,构建了一个具有真核细胞neo基因筛选标记和LacZ基因的真核表达重组体pSV2neo-beta-gal．将该重组体导入HeLa细胞,经G418筛选获得了能稳定表达β-半乳糖苷酶的HeLa转化细胞系HeLa-beta-gal．使用PARP酶抑制剂苯甲酸胺处理细胞5周,随后进行细胞基因组Southern杂交分析与细胞内容物β-半乳苷酶的活性检测．结果表明,经BA处理的HeLa-beta-gal细胞β-半乳糖苷酶的活性及杂交带密度与未经BA处理的HeLa-beta-gal细胞相比未有明显区别．结合以前的结果可以认为,PARP酶抑制剂BA并不能导致所有外源基因的丢失,且使用PARP酶抑制剂BA引起外源基因的丢失具有选择性．     

牛αS1-酪蛋白5′调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0.76 kb的人α-乳白蛋白基因(α-LA),构建真核表达载体 αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体 αS1-LA-psv 转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120 h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

大肠杆菌启动基因的重组和表达 Ⅰ.不同启动基因对β-半乳糖苷酶结构基因表达的影响

质粒pKL6带有β-半乳糖苷酶结构基因(lacZ),启动基因突变失活,lacZ不能表达。在lacZ前插入外源DNA片段,观察lacZ的表达,可以研究启动基因的功能作用。我们用大肠杆菌染色体DNA的HindⅢ片段与pKL6重组,获得一批重组体,对这些重组体的β-半乳糖苷酶的活力水平和限制性图谱作了分析,对它们用作表达载体的可能性进行了讨论。     

牛αS1-酪蛋白5'调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LaeZ)的PSV载体上,做为肩动子,在其后连接0.76kb的人仅α-乳白蛋白基凼(α-LA),构建真核表达载体αS1-LA-psv.采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力.将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L.实验结果表明,建它的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶.     

阳离子脂质体转染人类骨骼肌原代细胞的初步研究

探讨不同脂质体介导基因转染人类骨骼肌原代细胞的转染效率和基因的表达.将含有β-半乳糖苷酶LacZ结构基因的质粒,用三种不同的阳离子脂质体导入人类骨骼肌原代细胞中,通过X-Gal染色观察不同的转染效率.结果发现,Fugene 6转染效率最高,蓝染细胞达10%,其脂质体与DNA的最佳比例为3∶ 2.Fugene 6可有效地将外源基因导入骨骼肌原代细胞,而且外源基因可以长效高效地表达,有望用来作为基因治疗的载体.     

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉（Musasp．）果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA（MA-Gal）,序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5个β-半乳糖苷酶结构域（典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7个结构域）,推导的MA-Gal蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY（F）;系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因（该类主要在果实中表达）;β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal参与香蕉果实成熟过程中的软化。     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~rTc~s lac~ 转化体,得到另一个lac重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac的表达作了分析。     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA 片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac 插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~r Tc~s lac~ 转化体,得到另一个lac 重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac 控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac 的表达作了分析。     

牛αS1-酪蛋白5＇调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5＇调控序列约1．2kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0．76kb的人α-乳白蛋白基因（α-LA）,构建真核表达载体αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0．64g／L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5＇调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达

本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因 (TM_0310).以海栖热袍菌基因组 DNA(GenBank登录号 AE000512)为模板,设计特异性引物带有 NcoI-HindⅢ酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019 bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972 kD.该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与 Thermotoga petrophila RKU-1 来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank 登录号 ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank 登录号 EDQ29256.1)同源性最高,均为95%.重组转化子经诱导酶比活可达2.08 U/mg 蛋白.粗酶液经过80℃热处理10 min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景.     

假单胞菌M18转录调节因子σs基因与无启动子lacZ基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacZ)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpoS基因突变株M18SZ。Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β-半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定(OD600)的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

外源基因在蛙神经元中的表达

含β-半乳糖苷酶基因的真核表达载体DNA,直接注射到视神经切断或正常的黑斑蛙的视网膜中.注射2周后,观察到蛙视网膜神经细胞仍然有转染基因表达,这种基因转染对神经元的类型没有选择性.被转染神经元主要局限于注射点周围.蛙视神经切断后,被外源基因转染的细胞分布区域略广于视神经未切断的情况.     

Enzymatic synthesis of D-tagatose from lactose with the combination of β-galactosidase and L-arabinose isomerase

将大肠杆菌K-12中的β-半乳糖苷酶基因lacZ和L-阿拉伯糖异构酶基因araA以串联方式克隆到载体pET-28a(+)上,并转入大肠杆菌BL21( DE3)中进行表达.通过SDS-PAGE分析发现,重组菌株能表达出大量可溶性β-半乳糖苷酶蛋白和L-阿拉伯糖异构酶蛋白.以重悬菌液为酶源,可将乳糖降解为D-半乳糖,并将D-半乳糖转化为D-塔格糖.在温度为50℃,pH 7.0的缓冲液中,经一段时间反应后,D-塔格糖的转化率可达21％以上.加入Mn2+、Co2+和Fe2+均能够使D-塔格糖的转化率提高.     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性,将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点,构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ,重组质粒转化枯草芽孢杆菌,分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值,约为26mU/mL,之后开始下降;菌体沉淀中的酶活在14h最高,达6mU/mL,而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性,能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料,也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。