外源ble基因在杜氏盐藻中的瞬时表达

利用电击法将带有ble基因的pSP124S转入杜氏盐藻细胞内进行瞬时表达．研究了外源基因在盐藻内的存留及表达情况,确定了合适的电击转化条件,发现利用电击法可以使大量的质粒导入盐藻细胞,质粒在细胞中逐渐降解但至少96h内可以检测得到。外源启动子能够使ble基因有效转录,转录至少可以持续72h,ble基因能够在盐藻细胞中正确翻译,可以作为盐藻遗传转化研究的筛选标记。     

杜氏盐藻外源基因稳定表达系统的构建

建立了一种单细胞海水绿藻--杜氏盐藻(Dunaliella salina Teod.)的外源基因稳定表达系统.通过电激法将携带乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的质粒转入盐藻细胞内,CAT基因为筛选基因.PCR和Southern杂交结果显示,HBsAg基因已经整合到盐藻基因组中.Northern杂交结果表明,转化成功细胞内的该基因已转录成mRNA.HBsAgELISA和Western杂交检测证明,HBsAg蛋白在转化的盐藻细胞内稳定地表达.同时,PCR和Southern杂交显示,CAT基因也已整合到盐藻基因组中.且CATELISA检测证明,CAT蛋白在转化体中也已稳定地表达.进一步对转化盐藻进行无氯霉素筛选培养,60代后,HBsAg基因依然稳定地存在并表达.本实验第一次报道了外源基因在杜氏盐藻细胞内的稳定表达.     

杜氏盐藻外源基因稳定表达系统的构建(英文)

A stable transformation system for the expression of foreign genes in the unicellular greenmarine alga (Dunaliella salina Teod.) was established. Using electroporation, the alga was transformed witha plasmid containing the hepatitis B surface antigen (HBsAg） gene and the chloramphenicol acetyltransferase(CAT) gene as a selectable gene. PCR and Southern blotting analysis indicated that the HBsAEgene wasintegrated into the D. salina genome. Northern dotting analysis showed that the HBsAg gene was expressedat the mRNA level. The stable expression of HBsAg protein in transformants was confirmed by HBsAgenzyme-linked immunosorbent assay (HBsAg EUSA) and Western blotting analysis. Also, PCR and Southernblotting analyses showed that the CA Tgene was integrated into the D, salina genome, and CAT EUSAindicated that CAT protein was stably expressed in the cells. The introduced HBsAg DNA and HBsAgprotein expression were stably maintained for at least 60 generations in media devoid of chloramphenicol.This is the first report of the stable expression of foreign genes in D. salina.     

杜氏盐藻电击转化方法的系统优化

本研究系统分析了盐藻生长状态、电击条件、电击缓冲液成分和质粒浓度等条件对电击转化效率的影响。实验结果表明:正常接种后培养7d对数生长中期的盐藻细胞,在25μF、0.8kV的电击条件下加入终浓度为10μg/mL的质粒可使盐藻电击转化效率达到1.85‰;电击缓冲液中加入0.4mol/L的甘油可使转化效率显著提高至2.03‰(P<0.05)。在上述优化电击体系下,运用3种不同质粒分别转化盐藻细胞后获得的转化效率无显著差异。通过对电击转化中相关因素的优化,本研究建立了一种适用于杜氏盐藻的高效稳定的电击转化体系,为杜氏盐藻的转基因研究提供有效方法。     

甘油对杜氏盐藻电击转化的影响

通过在HEPES电击缓冲液中添加不同浓度的甘油,讨论了甘油对电转前细胞存活率的影响;通过在盐藻培养基中添加不同浓度的甘油,讨论了甘油对盐藻细胞生长的影响;使用含有不同浓度甘油的HEPES缓冲液介导质粒载体转入盐藻细胞,比较了甘油对于转化率的影响。实验结果表明,在电击缓冲液中添加0.5mol/L甘油能有效提高细胞存活率,促进转化细胞恢复生长,从而获得最佳转化效果。因此,0.5mol/L甘油可作为杜氏盐藻电击转化过程中一种良好的稳渗剂。     

SOEing 法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法（Gene splicing by overlap extension,SOEing）构建含有杜氏盐藻（Dunaliella salina）硝酸盐还原酶（NR）基因5′-上游序列（Pnr）and 3′-端序列（Tnr）的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。     

杜氏盐藻分子生物学最新进展及展望

杜氏盐藻是一种无细胞壁的单细胞双鞭毛真核藻类,是一种十分重要的藻类资源。过去对杜氏盐藻的研究多集中在形态学、耐盐机理及β-胡萝卜素等方面,近年来,随着藻类基因工程的快速发展,本研究课题组及国内外在杜藻盐藻分子生物学方面做了大量工作,现就杜氏盐藻在这一领域的研究进展进行综述,主要是重要功能基因的克隆与分析、杜氏盐藻调控序列的研究以及杜氏盐藻作为宿主表达外源基因等。     

外源报告基因EGFP在盐藻中实现瞬时表达

探索杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的转基因方法和筛选方法 .利用烟草花叶病毒启动子 (CaMV35S)、衣藻叶绿体atpA启动子与来源于水母的加强型绿色荧光蛋白报告基因 (EGFP)构建表达载体pART7GFP和pUCGFP ,转化盐藻 .EGFP在CaMV 35S启动下表达出绿色荧光蛋白 ,在荧光显微镜下看到发绿色荧光的转基因盐藻 .根据荧光数目进行统计 ,转化效率高于 5 % .衣藻来源的启动子atpA在盐藻中未能启动EGFP的表达 .用直径 1μm的金粉颗粒和 0 6 μm的金粉进行基因枪法转化 ,1μm的金粉颗粒成功将外源基因导入盐藻 ,用 0 6 μm的金粉配合多种技术参数也没有将外源基因导入盐藻 .EGFP可以用作盐藻遗传转化的报告基因使单细胞真核生物盐藻可以利用流式细胞术 (FACS)等技术进行筛选 ,从而避开平板筛选转基因盐藻的限制 ,并使转基因盐藻实现无抗生素筛选成为可能     

杜氏盐藻的耐盐机制研究进展和基因工程研究的展望

概述了杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的耐盐机制和基因工程的研究进展。盐藻的耐盐机制十分复杂 ,短时间内通过细胞体积的改变来调节渗透压平衡 ,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。渗透调节过程中 ,还涉及到蛋白质的合成。cDNA文库和基因组文库已经建立 ;几种基因已被克隆 ,如碳酸酐酶基因和硝酸还原酶基因等 ;GUS(β_葡糖苷酸酶 )基因已成功地转入盐藻细胞内。另外 ,对盐藻的基因工程作了简单的展望     

杜氏盐藻的耐盐机制研究进展和基因工程研究的展望

概述了杜氏盐藻（Dunaliella salina）的耐盐机制和基因工程的研究进展。盐藻的耐盐机制十分复杂,短时间内通过细胞体积的改变来调节渗透压平衡,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。渗透调节过程中,还涉及到蛋白质的合成。cDNA文库和基因组文库已经建立;几种基因已被克隆,如碳酸酐酶基因和硝酸还原酶基因等;GUS（β_葡糖苷酸酶）基因已成功地转入盐藻细胞内。另外,对盐藻的基因工程作了简单的展望。     

ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF GENES FOR P-TYPE ATPASE IN THE HALOTOLERANT ALGA DUNALIELLA SALINA (CHLOROPHYCEAE)1

A partial complementary DNA (cDNA) (DSA8) for a P-type ATPase was obtained from the halotolerant alga Dunaliella salina (Dunal) Teod. (Chlorophyceae). The cDNA exhibited greater than 90% homology to the cDNA for a H⁺-ATPase in D. bioculata Butcher. The expression of the gene that corresponded to DSA8 was decreased strongly by increases in NaCl concentration. The expression of a gene that corresponded to another ATPase (DSA1; possibly for a Ca²⁺-ATPase) from D. salina did not show the same decrease as did the DSA8. However, increased osmotic pressure due to glycerol resulted in the same decrease in the DSA8 gene. Under salt or osmotic stress, the activity of a H⁺-ATPase from microsomes of this alga also decreased. We suggest that expression of the gene for the plasma membrane H⁺-ATPase of D. salina is regulated by osmotic pressure rather than by the concentration of NaCl.     

蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响

经蛋白质化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、丁二酮（BTO）和对-氯汞苯甲酸（ρCMB）处理的盐藻细胞光合速率下降,0.17mmol/L的ρCMB和0.07mmol／L的NBS可完全抑制光合放氧。在藻细胞的可见光（400—700nm）区吸收光谱中,三种修饰剂都降低了整个波段的吸收。在两个主要吸收峰中,678nm吸收值的下降略大于436nm的下降。在紫外光谱区（200—300nm）,ρCMB和BTD使原吸收峰（203nm）值明显降低,NBS处理使吸收峰红移13nm。细胞胀破后紫外光谱出现更显著变化,峰位移至223nm（BTD）、250nm（NBS）,或至214—237nm而呈一个宽的平台（ρCMB）。紫外差示吸收光谱显示210nm的负峰;随修饰剂浓度增大,负差示峰可移到225nm（NBS）、245．5nm（ρCMB）和212nm（BTD）。     

吉兰泰杜氏盐藻中类胡萝卜素的分析和鉴定

利用高压液相色谱（ＨＰＬＣ）技术及ＩＲ、＾１Ｈ ＮＭＲ、ＭＳ、ＵＶ等现代测试手段,对吉兰泰杜氏盐藻中的类胡萝卜素等色素及胡萝卜素异构体进行了分析与鉴定。研究结果表明,吉兰泰杜氏盐藻中含有１１种类胡萝卜素,其中β－胡萝卜素包含７－顺式、９－顺式、１５－顺式、全反式等４种异构体。吉兰泰杜氏盐藻中的这些类胡萝卜素对人体十分有益,具有开发利用的价值。     

高渗震动对杜氏盐藻细胞跨膜K+运输的影响

杜氏盐藻细胞吸收K 的Km为 2 .86mmol/L ,Vmax为 1 .39μmol/1 0 8cells .h。钒酸钠和DES、CCCP、Li 抑制藻细胞对K 的吸收。高渗震动促进藻细胞H 的分泌 ,降低K 的吸收速率 ,CCCP和Li 减弱了高渗震动对藻细胞K 吸收的抑制。高渗震动对藻细胞K 分泌有轻微的抑制作用。     

盐生杜氏藻质膜ATPase及其对高渗震动的反应

用水溶性多聚物 ( dextran T5 0 0 PEG 335 0 )两相法制备盐生杜氏藻细胞质膜 ,经检测质膜纯度较高 ,原位膜约占 78%。质膜 ATPase的动力学常数 Km 和 Vmax分别为0 5 8mmol L和 4 3 5 9μmol Pi ( mg protein· h) ;最适 p H值是 7 5。质膜 ATPase的活性随Mg Cl2 和 Ca Cl2 浓度的升高而增加 ,但较高浓度的 Mg Cl2 和 Ca Cl2 有轻微的抑制作用 ;KCl促进质膜 ATPase的活性 ,在 1 0 0 mmol L时达到最大 ,高于 1 0 0 mmol L时抑制效应显著。钒酸钠、DES、DCCD和 NEM明显地抑制质膜 ATPase的活性 ;而 Na N3、Na NO3、Na Mo O4和KCN对质膜 ATPase的活性影响不大。高渗震动刺激了质膜 ATPase的活性。     

PEG介导的外源基因对绿豆叶肉原生质体的转化和瞬间表达研究(简报)

作者曾利用Krens等(1982)的PEG法将NPT-Ⅱ丛因直接导入绿豆原生质体并获得稳定表达,但该法的转化率极低。为了建立绿豆原生质体有效的转化系统,我们将PEG法在大豆原生质体转化的基础上进一步改进,利用GUS基因为报告基因,对三个不同品种的绿豆叶肉原生质体进行直接转化。并对影响PEG转化的有关因素进行了研究。     

盐生杜氏藻细胞光合特性的研究

研究了盐生杜氏藻细胞的光合特性获知：⑴在７００－３００ｎｍ波长范围,出现三个吸收峰,分别位于６８０．４８５和４００ｎｍ处;⑵测定了该藻细胞内ＡＴＰ／ＡＤＰ比值,钒酸钠处理可以提高ＡＴＰ／ＡＤＰ比值;⑶以培养液为反应介质,测出该藻细胞的光合放氧,钒酸钠抑制放氧速率;⑷用调制式荧光计测出该藻细胞的Ｆｏ,Ｆｍ以及经间隔饱和光脉冲引起的Ｆｍ,表明盐生杜氏藻具有正常的光系统结构;⑸该藻细胞可诱导可逆的光状态     

LOW-TEMPERATURE-INDUCED SYNTHESIS OF α-CAROTENE IN THE MICROALGA DUNALIELLA SALINA (CHLOROPHYTA)

The microalga Dunaliella salina (Teo.) is well known as an accumulator of β-carotene (β,β-carotene) when subjected to growth-limiting conditions (e.g. exposure to high irradiances). In addition, the carotenoid α-carotene (β,ε-carotene) may also be synthesized and subsequently accumulated by this alga under specific growth conditions. The main factor in stimulating the synthesis of this carotene was determined to be exposure to lower than optimum temperatures for algal growth. A 7.5-fold increase in the levels of α-carotene was observed when the temperature was decreased from 34 to 17° C, whilst levels of β-carotene were unaltered. The accumulation of α-carotene was unaffected by irradiance, although its isomeric composition was greatly altered by light levels. The proportion of 9- cis α-carotene increased from 15% to 45% of total α-carotene when the irradiance was decreased from 260 to 50 μmol·m⁻²·s⁻¹. Exposure to higher irradiances had little influence on the isomeric composition of this carotenoid. A reduction in growth temperature did not influence the isomeric composition of α-carotene. Nutrient status (nitrogen and phosphate) had no effect on either the content or isomeric composition of α-carotene accumulated by D. salina.     

A SALT-INDUCED CHLOROPLAST PROTEIN IN DUNALIELLA SALINA (CHLOROPHYTA)1

The unicellular green alga Dunaliella salina Teod, is halophilic and wall-less. The cell acclimates to osmotic stresses by accumulation or degradation of glycerol. To investigate other mechanisms involved in its physiological recovery following hyperosmotic shocks, protein profiles from cells grown in various salinities were compared. A 13-kDa protein (P13) accumulated when cells were subjected to drastic hyperosmotic shock. Front our results with antibiotic-treated cells and purified chloroplasts, we believe that this component results from de novo translation in chloroplasts. The solubility of P13 was strongly promoted by Triton X-100. Its accumulation was correlated with the recovery of photosynthesis.