猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的RNA酶活性及其研究进展

猪瘟病毒（CSFV,Classicalswinefevervirus）属于黄病毒科瘟病毒属,同属的成员还有牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和羊的边界病病毒（BDV）。猪瘟病毒是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组大小约12．3kb,含有一个大的ORF,此ORF编码一个大的多聚蛋白,经宿主和病毒编码蛋白酶的共同作用,在共同翻译中和／或翻译后,将此多聚蛋白加工成病毒的结构蛋白和非结构蛋白．猪瘟病毒基因组的5＇端编码病毒结构蛋白,即衣壳蛋白（C）和三个囊膜糖蛋白（E0、E1、E2）。其中E0和E2能够刺激机体产生中和抗体,并使猪获得免疫力[1,2]．意外发…     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3基因的重组伪狂犬病病毒的构建

猪繁殖与呼吸综合征 (porcinereproductiveandrespiratorysyndrome ,PRRS)是引起怀孕母猪早产、流产、死胎及仔猪呼吸系统疾病的一种新发现的病毒性传染病[1] .该病毒的基因组为单股正链RNA ,约15kb ,含有 8个开放阅读框架 (ORFs) ,ORF1编码病毒非结构蛋白 (依赖RNA的RNA聚合酶 ) ,ORF2 ORF7编码病毒的结构蛋白 .其中ORF3含有 2 6 5个氨基酸 ,编码的GP3蛋白为高度糖基化的结构蛋白 ,有 7个糖基化位点 ,具有免疫原性[2 ,3 ] .目前 ,用于预防PRRS的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗 ,虽然都有一定的免疫效果 ,但由于PRRS抗体依赖性…     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2～4特异siRNA的筛选及其抑制病毒复制效果的研究

RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具,为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个）,构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体,转染MARC-145细胞后,通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量,细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。     

大麦黄矮病毒GAV株系ORF4基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及亚细胞定位

根据已报道的大麦黄矮病毒GAV株系(BYDV-GAV)相关基因序列,利用RT-PCR方法获得ORF4基因。在杆状病毒-昆虫细胞系统中,成功表达了ORF4和GFP（绿色荧光蛋白）的融合蛋白(GFP: ORF4),Western blot检测到目的蛋白的表达。利用激光共聚焦显微镜观察其在细胞中的积累和亚细胞分布,发现ORF4基因编码的17 kD蛋白（P4）能进入细胞核,并在细胞核膜上聚集。通过对ORF4基因编码的P4蛋白的N端和C端缺失突变结合蛋白质的结构预测分析,鉴定出N端α螺旋结构对于P4蛋白的核膜定位是必需的。这些结果为进一步研究ORF4基因在黄矮病毒GAV系统侵染中的生物学功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒华东地区分离株RT-PCR-RFLP分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪的一种重要传染性疾病病原,已给世界养猪业带来了巨大的经济损失.其主要临床表现为妊娠期母猪的早产、流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎,新生仔猪肺炎、生长迟缓.PRRSV为动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员.病毒有囊膜、呈球形,基因组为单股正链RNA,大小约15kb,含有8个开放阅读框(ORF),其中ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒RNA复制酶;ORF2-7分别编码病毒结构蛋白:GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白.     

自然界斜纹夜蛾核型多角体病毒的基因型多态性

【目的】从基因组序列角度进一步揭示自然界斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus, SpltNPV）的基因型多态性。【方法】病毒克隆A5, F1, X3 和 X15分别以活体克隆法分离自SpltNPV埃及株、 日本福冈株和日本小笠原株。根据SpltNPV基因组全序列（GenBank登录号: AF325155）和海灰翅夜蛾核型多角体病毒（S. littoralis NPV, SpliNPV）部分基因序列（GenBank登录号: X99377, X99376 和X98924）设计引物, PCR扩增获得A5, F1, X3 和 X15的多角体蛋白（polyhedrin, polh）基因和ORF18~ORF23序列。【结果】根据多角体蛋白基因序列, X3和X15属于SpltNPV型, 而A5和F1属于SpliNPV型。将A5, F1, X3 和 X15的ORF18~ORF23与SpltNPV和SpliNPV相应的基因序列进行同源性比较。结果发现, F1与SpliNPV以及X3与SpltNPV的核苷酸序列相似性高, 但X3的ORF20在172~558 nt处缺失387 bp。尽管依据多角体蛋白基因序列X15属于SpltNPV型, 但对于ORF18~ORF23序列, X15与SpliNPV的相似性高于与SpltNPV的相似性。同样, A5属于SpliNPV型, ORF18~ORF20与SpliNPV相应的核苷酸序列相似性高, 但ORF21与SpltNPV相应的核苷酸序列一致性为100%, 特别是ORF22, SpltNPV的特有序列出现在A5的基因组中, 而且与SpltNPV的ORF22一致性为100%; 反过来, ORF23又与SpliNPV相应的核苷酸序列相似性高。【结论】所有这些都表明, SpltNPV在自然界不仅存在基因型多态性, 而且即使属于同一基因型, 它们的基因组序列也有显著差异。可利用SpltNPV在自然界的这种异质性筛选适宜防治斜纹夜蛾幼虫的株系。     

PRRSV全长感染性cDNA克隆的构建：非结构蛋白和结构蛋白之间编码区的分离

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是近两年来流行于我国大部分省份的“猪高热综合征”的主要病原体．该病毒在繁殖过程中具有遗传多变性和高频率的抗原突变．如何设计有效的疫苗来防治持续多变的流行变异株是研究者所关注的焦点．本研究中我们构建了Ⅱ型PRRSV弱毒株的感染性cDNA克隆,并对编码结构蛋白的ORF1和编码结构蛋白的ORF2之间插入几个酶切位点．通过RT-PCR和DNA测序以及分子克隆方法,获得了细胞致弱株（APRRS）的全长cDNA克隆．APRRSV基因组RNA为15521个核苷酸（不包括poly（A）尾）．与PRRSV Nsp株和疫苗株的相似性均为99．7％．根据测序结果,利用基因组上的酶切位点将全长PRRSV cDNA克隆到pBlueScript载体中,在病毒5＇末端引入T7启动子序列．为了区分重组病毒和亲本病毒,在ORF5编码区引入Mlu I酶切位点．将最初构建的全长cDNA和带有Mlu I酶切位点的cDNA分别体外转录成RNA后转染MA-104,均能够观察到典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）．拯救的重组病毒与亲本病毒有着相同的病毒学特性．通过突变PCR的方法将编码非结构蛋白基因ORF1和编码结构蛋白基因ORF2-7之间的编码区分离,从而构建了克隆pCSA．pCSA体外转录产物具有感染性,而且拯救的病毒与亲本病毒具有相同的病毒学特性．本研究为构建嵌合病毒作为疫苗候选株以此对遗传多变的PRRSV毒株提供有效的交叉保护提供了宝贵的工具,同时也为建立PRRSV为基因表达载体来构建针对其他重要的猪源疾病重组疫苗搭建了一个很好的平台．     

丙型肝炎病毒基因组结构及功能

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是单股正链的RNA 病毒,全长为9.6 kb,包括1个大的开放阅读框（ORF）和两侧的5′,3′非编码区（UTRs）.核糖体通过进入HCV 5′UTR 端的内部核糖体进入位点（IRES）,将HCV基因组翻译成1个聚蛋白前体.前体聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成为若干个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分别命名为C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B,它们不但在HCV的生活史中发挥着重要的作用,也影响着宿主细胞的信号传导、凋亡及物质代谢等一系列生化过程.近年来,随着HCV体外细胞摸型的不断发展,其病毒分子生物学方面的研究取得了很大的进展.本文从基因组结构及其编码的蛋白功能等方面阐述了HCV病毒的研究进展,为致病机理的研究及抗HCV药物的开发和疫苗研制等提供理论基础.     

舞毒蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆、测序和表达

从东北林业大学实验林场采集并纯化了舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV-NEFU)。用蛋白酶K消化,提取了病毒基因组DNA。用PCR方法,克隆出了该病毒的多角体蛋白（polyhedrin)基因,并对该基因进行了序列测定。结果显示,该基因序列是一个含有735个碱基对的开放阅读框（ORF）,该阅读框编码245个氨基酸。有5对碱基与加拿大病毒株LdMNPV-G的多角体蛋白基因序列存在差异。LdMNPV-NEFU分离株的多角体蛋白基因的第54,109,379,508和701位（从起始密码子中的A开始）分别是C,G,T,C和G,而LdMNPV-G分离株的多角体蛋白基因（ORF）相应位置上的碱基分别是G,C,C,T和T,两个ORF编码的对应位置的氨基酸绝大多数相同,只有一对不同,即由LdMNPV-NEFU编码的天冬氨酸和由LdMNPV-G编码的对应位置的组氨酸。以质粒pT-7-7为载体,多角体蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了原核表达。     

水痘-带状疱疹病毒ORF7蛋白原核表达及单抗制备

水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zoster virus,VZV）减毒活疫苗株（V-Oka）为混合毒株,仍具备感染和潜伏神经系统的能力,VZV第7个开放阅读框（Open reading frame7,ORF7）嗜神经因子敲除的毒株有望成为更安全的VZV减毒活疫苗株,本文重组表达VZV ORF7蛋白,制备其单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,建立ORF7荧光抗体检测方法,为新一代ORF7敲除的VZV减毒疫苗的检测提供方法学基础。本研究以V-Oka株orf7为扩增模板,构建重组表达质粒pET-28a-ORF7,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,镍离子柱亲合层析纯化表达蛋白,WB鉴定重组蛋白的活性,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备抗VZV ORF7单克隆抗体,对单抗进行鉴定,选取一株稳定、特异、高效的单抗进行纯化并标记异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）。结果显示,重组ORF7蛋白以包涵体形式表达,分子量约29 kD,亲和纯化后纯度约为92.0%,盐酸胍复性蛋白可与VZV全病毒免...     

整合猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的重组鼠白血病病毒特性

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒完整的GP5基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果与已经登陆GenBank 的EF488048高致病性江西株比对分析表明碱基同源性达98.7%。构建含GP5基因的真核表达载体pcDNA-GP5, 通过与鼠白血病病毒(MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染人胚肾细胞293T, 48 h后收集假病毒上清, 超离后通过Western-blot证明GP5蛋白在假型病毒颗粒表面存在, 表明GP5蛋白被整合到此假型病毒粒子表面。通过感染293T、Mark-145不同的靶细胞,证实所构建的假型病毒粒子具有感染性。成功构建了具有感染性的MuLV-GP5假病毒体系, 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

整合猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的重组鼠白血病病毒特性

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒完整的GP5基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果与已经登陆GenBank 的EF488048高致病性江西株比对分析表明碱基同源性达98.7%。构建含GP5基因的真核表达载体pcDNA-GP5, 通过与鼠白血病病毒(MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染人胚肾细胞293T, 48 h后收集假病毒上清, 超离后通过Western-blot证明GP5蛋白在假型病毒颗粒表面存在, 表明GP5蛋白被整合到此假型病毒粒子表面。通过感染293T、Mark-145不同的靶细胞,证实所构建的假型病毒粒子具有感染性。成功构建了具有感染性的MuLV-GP5假病毒体系, 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究

为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。     

Immunogenicity of recombinant vaccinia virus vaccines co-expressing GP3/GP5 of European PRRSV and Cap protein of PCV2 in pigs

Applied Microbiology and Biotechnology - Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is almost always caused by the North American strain of PRRS virus (PRRSV) in China; the European...     

Resonance Raman spectroscopy of complexes of the helix destabilizing proteins GP32 and GP5 with poly(rA) and poly(dA)

The bacteriophage T4 helix destabilizing protein (hdp) gp32 and its complexes with poly(rA) and poly(dA) were studied with ultra-violet resonant Raman spectroscopy. The UV-resonant Raman (UV-RR) spectrum of the complex of gp5, the coat protein of bacteriophage M13, with poly(dA) was also measured and is compared with the spectrum of the gp 32/poly(dA) complex. The excitation wavelength was 245.1 nm. This is on the far UV-side of the first absorption bands of adenine and near a "window" in the protein absorption spectrum. The overlap of fluorescence due to chromophores present in the protein and resonance Raman scattering was prevented by this choice of wavelength. The spectra of the protein/polynucleotide complexes are compared with the native nucleotide spectra measured at varying temperatures. The hyperchromicity which is expected when a nucleotide changes from a stacked to an unstacked conformation was not observed for poly(rA), neither upon temperature increase nor on protein binding. In both cases poly(dA) revealed a clear hyperchromicity. This different behavior of poly(rA) and poly(dA) is probably a consequence of their different conformations. The contributions of the proteins to the spectra is weak except for two bands, at 1550 and 1610 cm-1 due to tryptophan (in case of gp32) and one band near 1610 cm-1 due to tyrosine and phenylalanine.     

猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5蛋白原核表达初步研究

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reprodutive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)引发的病毒性传染病,病症主要表现为怀孕母猪早产、流产、木乃伊胎以及仔猪呼吸症状和高死亡率[1,2]。该病于1987年首先在美国爆发[3],1990年德国亦发现此病,并迅速传播到欧洲其他国家。我国在1996年报道有该病流行[4],由于该病的迅速蔓延使整个世界养猪业遭受了巨大的经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)成员,为有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组为15Kb,含有7个开放阅读框, ORF ( Open readingframes,ORF),…     

融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK-/gE-/VP22GP5+的构建

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudora-bies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性传染病。而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1]。已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus,HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后,能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和“一针防两病”的独特优点。由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive …     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入。获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株。纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSVGP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白。猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5蛋白原核表达初步研究

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reprodutive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引发的病毒性传染病,病症主要表现为怀孕母猪早产、流产、木乃伊胎以及仔猪呼吸症状和高死亡率[1,2].该病于1987年首先在美国爆发[3],1990年德国亦发现此病,并迅速传播到欧洲其他国家.我国在1996年报道有该病流行[4],由于该病的迅速蔓延使整个世界养猪业遭受了巨大的经济损失.