SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

目的建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系.方法根据已发表的SV40病毒T基因序列设计引物,以整合有SV40 DNA早期基因区的COS-1细胞基因组DNA为模板,用高保真PCR扩增SV40 T基因.将获得的SV40 T基因克隆入真核表达载体,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞.经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆,对其生物学特性进行研究.结果扩增出序列正确的SV40T基因,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第4天,细胞群体倍增时间为23.5*!h,克隆形成率为26.7%.DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV40 T基因,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长.部分细胞克隆已在体外传30代以上,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征,在胶原基质上能形成腺泡样结构.结论本研究获得的SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性.     

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒。亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主。感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化。本研究初步建立了SV40 病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺。使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性。随后对SV40 病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合。本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40 感染实验奠定了良好的基础。     

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒.亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主.感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化.本研究初步建立了SV40病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β-丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺.使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性.随后对SV40病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合.本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40感染实验奠定了良好的基础.     

恒河猴外周血及肾组织SV40病毒基因分析

SV40即猿猴病毒40 (simian virus 40),是DNA肿瘤病毒的原型代表,其基因结构为共价闭合环状双股DNA分子,标准参考株SV40-776含5243个核甘酸。不同分离株bp数略有差异。SV40病毒为强DNA肿瘤病毒,具有使啮齿类动物及人源多种组织培养细胞永生化和转化能力。SV40病毒早期基因编码两个早期非结构蛋白即小T抗原(ST-ag、)和大T抗原(LT-ag),与病毒诱导的肿瘤发生有关。近年来研究表明,从猴体组织新分离的SV40株与实验室参考株SV40-776及SV40-B株相比较,具有明显的遗传异质性,并且SV40遗传变     

小剂量DNA毒剂诱导SV40转化的人细胞中的SV40DNA的增强复制

本文介绍了用~(32)P标记的pSV_2质粒为探针,通过DNA分子原位杂交研究小剂量DNA毒剂诱导被SV40转化的人细胞NB—E中SV40DNA的增强复制.最佳条件下,最大增强比可达4-5.而且,这种病毒DNA增强复制与病毒的增强复活与增强致突有相似的动力学过程和剂量响应关系.此结果为哺乳类细胞中可能存在SOS功能提供了进一步证据.被诱导细胞的Hirt沉淀与Hirt上清液中都存在SV40DNA片段,且Hirt上清液中SV40DNA片段大小均一,反映此过程与λ原噬菌体的诱导的起始过程有相似之处.小剂量紫外线可诱导被SV40转化的人XP细胞中的SV40 DNA的增强复制.说明这一诱导过程可能与切除修复功能有不同的遗传学过程.     

SV40病毒的培养、增殖及鉴定

目的：建立SV40病毒在Vero细胞上培养的方法,观察其生长过程,获得SV40病毒,并建立相应的SV40病毒检测方法,为SV40灭活疫苗的制备奠定良好的基础。方法：在Vero细胞上培养和增殖SV40-776株病毒。收获病毒后,应用PCR、免疫荧光以及克隆特异性片段进行测序比较来鉴定SV40病毒。结果：SV40在Vero细胞中增殖很快,并且使细胞出现明显的病变。小规模分离到了SV40病毒颗粒,获得了病毒DNA。不同的鉴定方法均显示出良好的特异性。结论：探讨了SV40病毒病变的基本过程,建立了病毒的培养、增殖和鉴定的方法。     

SV40病毒和多瘤病毒:通过DNA体外重组对它们进行分析以及用它们做真核系统的载体

在过去的二十年里,致瘤的乳多泡病毒(Papovaviruses)--猿猴病毒40(SV40)和多瘤病毒(Polyoma Virus),已经成为使人们产生强烈兴趣的对象。这是由于它们具有两种生物学特性。第一,它们是致瘤的,当把它们接种到适当的实验动物时,就会诱导出肿瘤。现代病毒学尚未解决的主要问题之一,就是这些病毒把一个正常细胞转化     

SV40病毒和多瘤病毒:通过DNA体外重组对它们进行分析以及用它们做真核系统的载体

在过去的二十年里,致瘤的乳多泡病毒(Papovaviruses)——猿猴病毒40(SV40)和多瘤病毒(Polyoma Virus),已经成为使人们产生强烈兴趣的对象。这是由于它们具有两种生物学特性。第一,它们是致瘤的,当把它们接种到适当的实验动物时,就会诱导出肿瘤。现代病毒学尚未解决的主要问题之一,就是这些病毒把一个正常细胞转化     

一株高度变异的中国SV40分离株的全基因组序列分析

对SV40中国云南分离株YNQD38进行了全基因组核苷酸序列测定。覆盖了整个基因组的9个重叠的基因片段被扩增和测序,与其它SV40株进行了序列比对并基于全基因序列建立了遗传进化树。结果显示:基因组全长5125bp,基因组构成与其它SV40毒株相似,均有6个开放读码框架和1个调控区。YNQD38与已被证实高度保守的其它SV40比,全基因组核苷酸同源性仅为91.0%。在SV40的保守区VP1、VP2、VP3、小t抗原(t-ag)和部分大T抗原(不包括大T抗原C末端)区,YNQD38与其它SV40之间核苷酸同源性分别为90.7%~91.1%、91.7%~92.0%、90.2%~90.8%、92.8%~93.3%、88.5%~89.7%。在SV40的可变区大T抗原C末端(T-ag-C)编码区,YNQD38同源性更低,仅为65.7%~74.3%。YNQD38发生在保守区的核苷酸变异多为无义突变,而发生在变异区的核苷酸变异多为有义突变。YNQD38的调控区缺少一个完整的72bp增强子,这种特别的调控区的结构以前未见报道。基于整个基因组构建的进化树显示该株病毒形成了一个独特的组。以上结果表明YNQD38是目前报道的SV40中变异最大的一株,而且也是第一株被完整测序的SV40中国株。这个报道不仅为SV40中国株的基础研究提供了一个完整清楚的分子生物学资料,还对这样一株高度变异的SV40能否成为人类致病因子进行了初步探讨。     

pZ189质粒DNA体外复制系统的建立

报道了含SV40复制起点的质粒DNA在真核细胞抽提物中进行复制的DNA体外复制系统的建立. 在外源性蛋白质SV40大T抗原(SV40 Tag)的参与下,穿梭质粒pZ189能在猴肾vero细胞胞浆抽提物中,利用其中参与体内DNA复制所需的蛋白质成分,有效地进行体外DNA复制. 从而为研究真核细胞DNA复制系统的结构与功能提供了简单、有效的模型.     

利用5型腺病毒晚期启动子在真核细胞中表达乙型肝炎病毒表面抗原

近年来,随着基因工程研究工作的迅速发展,病毒载体越来越受到重视。用腺病毒(AdV)做载体也早已有人研究。Carl Thummel等构建了AdV-SV40重组体,在AdV晚期启动子控制下表达SV40T抗原。我们用AdV5晚期启动子(LLP)构建了一个新的质粒。用SV40启动neo基因做为真核细胞筛选标志,用AdV5 LLP在Vero细胞内表达HBsAg。并单独用AdV5LLP代替SV40早期启动子,在Vero细胞内表达neo基因。     

野生及笼养猕猴SV40T抗原基因检测方法的建立

目的建立猴外周血单核细胞SV40DNA的PCR检测方法,对猕猴SV40T抗原基因进行检测。方法使用PCR方法对分别来自野外（云南宁蒗71只、景东60只）及笼养猕猴（64只）的SV40大T抗原基因进行检测,同时对扩增出的阳性结果进行测序。结果在195份样本中,有4只来自野生猴样本扩增出SV40大T抗原基因（3．1％,4／131）,1只来自笼养猴样本扩增出SV40大T抗原基因（1．6％,1／64）。测序结果显示：猴血样本扩增片段序列与GenBank中的SV40大T抗原C-末端的基因序列片段有15个核苷酸不同（3．3％差异）,与SV40．776标准株的序列基本一致,但SV40—776在nt3020处有一缺口。结论云南野生及笼养猕猴猴群均能检出SV40T抗原基因。因此建立SV40病毒的DNA检测技术,对用于科研及疫苗生产的实验猕猴的病毒学质量控制具有重要意义。     

SV40 TAg转基因小鼠模型的建立及其表达

为了建立中枢神经系统肿瘤小鼠模型,构建了大鼠神经元特异性烯醇化酶(ratneu-ron-specificenolase,NSE)基因启动子调控下的猿猴病毒40大T抗原基因(simianvirus40largeTantigengene,SV40TAg)转基因载体,通过受精卵雄原核显微注射的方法制备转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型;RT-PCR和Northern印迹检测转基因阳性鼠中SV40TAgRNA水平的表达及其组织特异性;免疫组化检测其蛋白质水平的表达。经显微注射共获得9只首代转基因阳性鼠(首建者,Founder小鼠),其中2例出生时即发生神经干细胞来源的肿瘤,其他Founder小鼠经繁育后共建立了5个SV40TAg转基因小鼠系,其中有4个系检测到SV40TAgRNA水平的表达且特异性地表达于脑组织,但未检测到蛋白质水平的表达。研究表明NSE启动子活性具有较强的组织特异性,并起始于小鼠胚胎发育期;SV40TAg具有明显的致癌作用,且SV40TAg诱发的神经系统肿瘤易造成转基因小鼠早期死亡。     

Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag的转基因小鼠肿瘤模型

目的研究Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag小鼠肿瘤模型的肿瘤发生和基因表达情况,探讨c-myc基因的作用。方法用pTRE2-c-myc单阳性转基因小鼠和Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠交配,后代检测得到Tet-onp、TRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠,经强力霉素诱导一段时间以后,观察肿瘤的发生;通过RT-PCR、病理组织切片和磁共振等方法对肿瘤的发生部位和时相进行研究。结果Tet-on、pTRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠①经诱导后发生肿瘤,且发瘤率和发瘤时间高于和短于Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠;②c-myc和SV40Tag基因在表达部位上有所不同。结论c-myc和SV40Tag基因同时表达与SV40Tag基因单独表达时相比,肿瘤发生明显增强,提示c-myc基因与肿瘤的发生有着密切关系。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许—奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许-奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

永生化后细胞的生物学特性

近年来,永生化细胞技术快速发展,对细胞生物学特性的研究及其临床应用具有深远的意义。目前通过导入永生化基因SV40抗原和hTERT基因成为细胞永生化的常用方法,但存在安全性隐患。利用可逆性永生化技术,使细胞在获得永生化能力的同时去除永生化基因,使细胞恢复到原始状态。文章综述了永生化后细胞生物学特性的变化,并讨论了临床应用可能面临的问题。     

A33启动子结肠癌特异性探究及SV40增强子对其转录活性影响

为了探究A33核心启动子结肠癌特异性及SV40增强子对其转录水平的影响,该研究通过构建A33核心启动子和带SV40增强子的A33核心启动子(eA33)的荧光素酶报告基因载体pGL3-A33和pGL3-eA33,与内参照pRL-SV40质粒共转染至不同的细胞系中,利用双荧光素酶检测系统检测分析了A33和eA33启动子在不同细胞系中的转录活性。结果显示,A33核心启动子在结肠癌细胞系中具有转录活性低,但结肠癌特异性好的特点,而在其他类型癌细胞中基本没有活性。同时发现,eA33在各类癌细胞中的转录水平与A33相比,均呈大幅度提高,有显著性差异(P<0.01),但SV40增强子能显著增强A33启动子转录活性的同时减低了其结肠癌特异性。这为靶向癌症基因—病毒治疗策略在结肠癌的生物治疗应用中寻找结肠癌特异性的启动子奠定了研究基础。     

SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下进行滴度值测定。用SV40T慢病毒载体转染肝癌Hep G2细胞,并在荧光显微镜下行转染效率测定;实时荧光定量PCR检测转染细胞SV40T基因的表达水平。结果 Gateway技术构建的慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为1.73×108 TU/m L。慢病毒载体成功转染Hep G2细胞,转染效率约70%,并通过RT-PCR检测SV40T表达水平明显升高。