人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达与配体结合活性的鉴定

血管内皮生长因子受体(VEGFR)是血管内皮生长因子的特异性受体,VEGFR-2在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用.在大肠杆菌中实现可溶性的人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达,并鉴定其与配体结合的活性.采用重叠PCR的方法合成人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区基因,将该基因与高效表达载体pET-32a重组,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,表达产物依次经过CM阳离子交换树脂和镍柱亲和层析纯化.利用ELISA法和体外抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞增殖实验检测表达产物与配体结合的活性.SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以可溶性Trx-KDR3融合蛋白表达于胞质,30℃时1 mmol/L IPTG诱导细菌5 h融合蛋白表达量约占胞质可溶性总蛋白的20%,经CM阳离子交换树脂和镍柱亲合层析纯化得到纯度为95%的产物,Western blotting鉴定是目的蛋白.ELISA和体外HUVEC细胞增殖实验显示,表达产物具有特异性结合hVEGF165的活性,且该作用呈一定的浓度依赖性.具有配体特异性结合活性的可溶性人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区成功表达,为靶向血管抗肿瘤治疗和相关抗体的研究奠定了基础.     

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

一种新的遍在蛋白融合基因Uba256的克隆及表达

斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus ,SpltMNPV)的Uba2 5 6基因是已知昆虫病毒基因组中惟一编码遍在蛋白与GP37融合蛋白的基因。通过PCR方法扩增得到该基因及其N端的遍在蛋白编码区与C端的GP37编码区。将这 3个基因片段分别克隆至质粒pBV2 2 0与pQE30 ,构建得到重组质粒pB VUBCP、pQEUB与pQECP。pBVUBCP转化大肠杆菌DH5α ,经热激诱导表达了一条 38kD的蛋白带 ,证明Uba2 5 6表达的蛋白在大肠杆菌中没有发生剪切。pQEUB、pQECP转化大肠杆菌M15 ,经IPTG诱导 ,Western印迹分析结果表明遍在蛋白与GP37蛋白获得高效表达。以Ni2 NTA偶联抗体检测证明所表达的蛋白质均为融合蛋白质。纯化的融合蛋白质免疫新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western印迹检测结果显示 ,SpltMNPV遍在蛋白抗体及GP37抗体均与表达的融合蛋白质呈阳性反应 ,表明所表达的融合蛋白质仍保持原有蛋白质的免疫原性。以获得的抗体对感染SpltMNPV 72h的Sl zsu 1细胞进行检测 ,发现仅有一条 34kD的蛋白质带与GP37抗体发生特异反应 ;而有 4条分子量分别为 14、2 4、33、5 1kD的蛋白质带与遍在蛋白抗体发生特异反应 ,表明Uba2 5 6基因表达的蛋白质在宿主细胞内发生了剪切。     

鲎血细胞中脂多糖结合蛋白TALF在大肠杆菌中的表达研究

TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素（LPS）的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因（GST-TALF）能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。     

文摘

010 112绿色荧光蛋白与黄瓜花叶病毒运动蛋白融合基因的构建及在大肠杆菌中的表达 [中 ]/李睿… / /农业生物技术学报 .-2 0 0 1,9(1) .- 19～ 2 2采用重组 -ＰＣＲ方法 ,扩增获得绿色荧光蛋白 (ＧＦＰ)与黄瓜花叶病毒运动蛋白 (ＣＭＶＭＰ)融合基因 ,将其克隆到ｐＫＥＮ上 ,构建了该融合基因的原核表达载体 ｐＫＥＮＧ -Ｍ。ＳＤＳ -ＰＡＥＧ及免疫印迹分析显示 ,5 7ｋＤ的融合蛋白基因在大肠杆菌ＤＨ5ａ中正确表达。激光共聚焦显微镜分析表明 ,在 488ｎｍ光激发下 ,菌体呈亮绿色 ,表明融合蛋白保持绿色荧光特性。实验结果为进一步研究ＣＭ…     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达

目的：IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达。方法：分别在金黄色葡萄球菌肠毒素A227Ala、B基因的两端克隆上两个酶切点Hind Ⅲ,Kpn Ⅰ。将IL-2基因突变,设计一段linker使之分别与SEA227Ala和SEB相连并克隆到PET表达载体中,在大肠杆菌DH5a（DE3）-Pass中表达。结果：表达的蛋白占总蛋白15%。结论：IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合蛋白能在大肠杆菌中有效表达。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR-Fc是人炭疽毒素受体（ATR）的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3-1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA31/ATR9Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中,用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10～15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性,表明ATR-Fc可与PA特异性结合。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

大肠杆菌脂蛋白与CTB-pres2抗原基因的融合及表达

首次采用基因融合方式,在乱毒素B亚基-乙型肝炎病毒Pres2抗原融合基因（ctxB-Pres2）的5’端了引入编码大肠杆菌脂蛋白信号肽及N端九个氨基酸的核苷酸序列,分别置于ctb及lpp／lac启动子下在大肠杆菌中获得分泌性表达．表达的融合蛋白均定位于膜上,并且可以和GM1、抗-CTB抗体及抗HBVPreS2单克隆抗体结合,说明该融合蛋白保留了CTB的基本高级结构及CTB、PreS2抗原的抗原性．3H-棕榈酸标记实验证实该融合蛋白发生脂肪化,为免疫原性研究奠定了基础．此外,还研究了不同信号肽和宿主菌对该蛋白表达的影响．     

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。     

SDH-SV2C-L4融合蛋白的表达及山梨糖脱氢酶活性检测

目的:构建SDH-SV2C-L4融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达具有山梨糖脱氢酶(SDH)活性的融合蛋白。方法:将C亚型突触囊泡蛋白2大突环L4(SV2C-L4)基因与SDH基因以GGGS柔性接头连接,在大肠杆菌DH5α中表达;用NBT染色和DCIP脱色的方法检测融合蛋白的SDH活性。结果:DNA测序及SDS-PAGE结果显示构建了融合蛋白表达载体,并表达了SDH-SV2C-L4融合蛋白,相对分子质量约80×103;DCIP脱色及NBT染色均检测到融合蛋白的SDH活性。结论:与SV2C-L4融合的SDH仍具有活性,为下一步SV2C-L4活性检测方法的建立及SDH与SV2C-L4的其他相关研究奠定了基础。     

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

本研究通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了HBV PreS_2抗原决定簇基因,与ctxB基因的3’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达30μg/ml,表达产物95％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂GM1结合,说明融合蛋白保持了CTB的基本高级结构和生物学功能;ELISA实验证明融合蛋白具有CTB和HBV PreS_2的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白的免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。     

抗人红细胞单链抗体与猪瘟E2蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白,本研究采用重叠延伸PCR方法将2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟病毒E2蛋白主要抗原编码区基因)拼接成融合基因2E8mE2,并插入原核表达载体pET-DsbA,将重组表达质粒pET-DsbA-2E8mE2转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)PlysS中进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,结果表明:2E8mE2融合基因在大肠杆菌中获得了表达,表达产物以包涵体形式存在,分子量约为65kDa,与预期的大小一致。分别采用亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性,红细胞凝集试验证实:2E8mE2融合蛋白复性效果良好,既能够与人红细胞结合,又能够与猪瘟病毒抗体反应,具有双功能特性。     

转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:转铁蛋白受体特异性富含于血脑屏障和肿瘤细胞的表面,是当前中枢神经系统疾病和肿瘤治疗中定向转运的重要靶标。拟获得在大肠杆菌中能高效可溶表达的转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素(SA)的重组融合蛋白。方法:根据GenBank数据库报道的SA的核苷酸序列分段合成基因,连接后经PCR获得完整的基因片段,插入pGEM-T载体中测序。将序列正确的SA基因与大鼠转铁蛋白受体单链抗体基因ox26-scFv分别插入原核表达载体pTIG-Trx中,构建重组表达克隆pTIG-Trx/scFv-SA,并在大肠杆菌中诱导表达。ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:对pGEM-T/SA克隆的测序结果显示,合成的SA基因与文献报道相符。重组融合蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,约占菌体上清总蛋白量的30%;ELISA结果表明该融合蛋白具备与转铁蛋白受体和生物素的结合的双重活性。结论:有活性的重组融合蛋白的获得为构建一个通用性的以转铁蛋白受体介导的血脑屏障和肿瘤转运靶向载体打下了基础。     

可溶性VEGF受体Flt-1的基因克隆及其活性产物在原核中的表达

可溶性血管内皮细胞生长因子受体 ( Flt- 1 )具有受体拮抗剂作用 ,可竞争结合血管内皮细胞生长因子 ,( VEGF)并与其膜表面受体 Flt- 1及 KDR形成异源二聚体 ,最终阻断 VEGF的生物学活性 .利用 RT- PCR技术从人脐静脉内皮细胞扩增出 Flt- 1胞外 ～ 区 c DNA片段 ,通过基因重组将该片段克隆于谷胱甘肽转移酶 ( GST)融合蛋白表达载体 PGEX2 -T中 ,连接产物转化大肠杆菌XL1 - blue,经 IPTG诱导可获大量稳定表达的 Flt- 1 - GST融合蛋白 .该表达产物经变性复性处理后 ,可特异性结合 12 5 - VEGF.大量具有活性的可溶性 Flt- 1的获得有助于新的抗肿瘤血管形成方法的探索 .     

烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草 (NicotianatabacumL .)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体 ,并导入大肠杆菌 (Escherichiacoli)JM10 9菌株中进行表达。全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位 ,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点 ,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用 ;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂 ,形成了明显的丝状菌体 ,证明真核生物的ftsZ基因与大肠杆菌的ftsZ基因有相似的作用。同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体 ,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析。实验结果表明 ,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关 ;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

《生物技术通讯》1998年分类索引——(第9卷 总第33～36期)

研究报告 n·RNA蔷=}f译起始区i级结构改变对干扰素基因在大肠杆菌中翻译的影响……张平武 王易伦 陆德如(1) 登革2型病毒43株prM基因片段在痘苗中的克隆与表达……………………孙 蕾 杨佩英 秦鄂德等(6) Cs3纤毛抗原表达调控机理的研究……………………………………………董自正 张兆山 李淑琴等(10) CS3抗原基因的表达及纤毛装配元件的研究…………………………………董自正 张兆山 李淑琴等(1 5) CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的嵌合表达载体…………………………董自正 张兆山 李淑琴等(20) 人白血病抑制因子的改构与在大肠杆菌中…