S1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1 核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下 ,该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒pUC19的实验证明 ,S1 核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在 2 5 μL总反应体积中 ,按 10 0ngDNA加入 5u至 17u的S1 核酸酶 ,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以S1 核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒 (5 37bp) ,经S1 核酸酶线形化后 ,成功地克隆到pMD18 T载体上。     

螺旋藻POD、CAT和SOD同工酶的研究*

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对毛乌素沙地碱湖的钝顶螺旋藻S3和鄂尔多斯螺旋藻S4与国外引进的钝顶螺旋藻S₁和极大螺旋藻S₂ 的POD、CAT和SOD同工酶进行了比较研究。结果表明 :4个样品的 3种酶同工酶带数目不同 ,依次是S₄ >S₃>S₁>S₂ ;S₃和S₄ 酶带数多 ,对环境适应性强 ,进化程度较高。螺旋藻不同种间的酶谱相似系数     

蚕豆叶绿体DNA BamH I克隆库的构建及含16S-25S rRNA基因克隆的分析

蚕豆叶绿体DNA(ct—DNA)经BamH I酶切产生26个片段,最大的为14．00kb,最小的为0．42kb。本文以pBR322为载体,E．Coli HB101为受体菌,采用标准分子克隆法构建了蚕豆ct—DNA BamH I克隆库,并从库中分离得到含叶绿体rRNA基因的克隆。32P标记的E．Coil 16S、23S rRNA能和蚕豆ct—DNA BamH I第6(B₆,5．65kb)和第9(B₉,4．70kb)个片段杂交,含有这二个片段的克隆分别命名为pVFB32和pVFBl6。利用几种限制性内切酶酶切和Southern印迹法构建了pVFBl6的物理图谱。pVFBl6电镜下观察到有一变性环(A—T丰富区),经Hind I酶切,电镜观察定位此A—T丰富区位于16S和23S rRNA基因的间隔顺序内,推测该环可能与DNA复制有关。     

硫霉素生物合成酶基因克隆的研究

利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y₃。通过对Y3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S．Cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y₃变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y₃积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9．8kb左右,插入片段大小为4．5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S．Cattleya。     

醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S₂（Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,Q Sepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S₂发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S₂基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5ɑ,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）从12 000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719^#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719^#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。     

超氧化物歧化酶切割超螺旋DNA的活性

在体外系统中,发现超氧化物歧化酶(SOD)具有切割超螺旋DNA的活性. 猪血和牛血Cu/Zn-SOD以及烟草Mn-SOD都能将超螺旋DNA转变为非超螺旋结构的缺刻环状DNA,进一步产生线状DNA. 它们只作用于超螺旋DNA而不作用于线状DNA. 这个事实排除了SOD样品中污染核酸酶的可能性. 用H₂O₂、胍基抑制或蛋白酶降解的实验结果表明,这两种酶的活性中心处于酶蛋白的不同部位.     

蓖麻蚕rDNA转录起始区核酸酶S1的敏感位点的特征结构

曾报道,蓖麻蚕rRNA基因的非转录间隔区内有1个单链核酸酶S1的超敏感位点,它具有d(AT)₁₈的特征结构^[1] .蓖麻蚕经饥饿,再食后.发现在该S1超敏感位点的下游还存在1个敏感位点,而在饥饿的情况下,未能检测到染色质上的这个敏感位点^[2].新确定的这个可诱导的单链核酸酶的敏感位点,它是一个d(GT)₁₀…d(AT)₁₀的特殊结构,具有易解链的特征.这个新确定的核酸酶S1的敏感点结构可能直接参与了rDNA的转录和复制的调控.     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

低温胁迫对螺旋藻脱氢酶活性的影响*

低温胁迫试验结果表明,处理的温度越低、天数越长,鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻S₁、引进的钝顶螺旋藻S₂和极大螺旋藻S₃细胞内脱氢酶活性越低。在每一种处理下,脱氢酶活性高低的排列顺序均为S₁>S₂>S₃。脱氢酶活性的Q₁₀值变化范围排列为S₁。     

金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达

这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在E．Coli中的高效表达。SDS—PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E．Coli细胞总蛋白含量的60%。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl—Su—perose疏水柱层析进行了分析。     

P2-DNA的转染及提纯

P₂-DNA即Phage 2型噬菌体的染色体DNA,是一条线状双股螺旋的DNA分子,分子量为2．2×10⁷Da。有19个碱基的牯性末端．可以连接成环状^[1]．1970年Bertani L.E. 和 Bertani G分离纯化得到P₂噬苗体并对其遗传学及理化特性进行了研究^[2],发现它在DNA复制,溶源性的控制以及基因重组等方面与温和性λ菌体不同;1979年Saint R B 等和Westoo A等先后研究了P₂-DNA的几种限制酶的切割图谱^[3]。P₂-DNA可望成为分子生物学研究的重要工具和实验材料。目前国内尚无这种材料．我们试图将少量的P₂-DNA转染获得P₂噬菌体,加以扩增纯化．抽提得到大量的P₂-DNA。为分子克隆和限制酶的研究提供有实用价值的材料和研究工具。     

遮阴和施氮对黄檗幼苗叶片光合特性和碳氮计量特征的影响

选取大田环境下3年生黄檗幼苗,采用人工控制双因素随机区组试验,在不同光照［全光照(S₀)、轻度遮光21.4%(S₁)和重度遮光8.7%(S₂)］和不同氮添加［无添加对照(F₀)、轻度添加(F₁)和重度添加(F₂)］条件下,测定黄檗幼苗叶片的相对叶绿素含量(SPAD值)、气体交换参数及碳氮化学计量特征,探讨黄檗幼苗对遮阴和施氮的响应机制。结果表明：(1)随着遮光程度增强,黄檗幼苗叶片的SPAD值、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)、碳氮比(C∶N)和瞬时光合氮利用率(PNUE)均呈现先增后降的趋势,两种遮光条件下SPAD均显著高于全光照环境;黄檗幼苗叶片的净光合速率(P_n)、水分利用率(WUE)和气孔限制值(L_s)逐渐降低;而叶片氮(N)和碳(C)含量均呈先降后升的趋势。(2)随氮添加量增加,黄檗幼苗叶片的P_n、WUE、L_s、N和C含量均呈先增后降趋势,T_r、G_s和PNUE则逐渐下降,而C∶N逐渐增加。(3)黄檗幼苗叶片的P_n在各光氮组合处理间均无显著差异;SPAD含量以S₁F₀、S₂F₀和S₁F₂处理组合显著较高,而以全光照(S₀)处理组合显著最低;T_r和G_s以轻度遮光(S₁)处理组合明显较高,而以S₂F₁、S₀F₂、S₂F₂明显较低;WUE和L_s均以S₀F₂显著最高,S₂F₂处理组合显著最低。黄檗幼苗叶片N和C含量在重度遮光/轻度氮添加(S₂F₁)时具有较大值,而其C∶N和PNUE在轻度遮光/无氮添加(S₁F₀)时具有较大值。(4)隶属函数综合评价认为,黄檗幼苗对光氮复合作用总体属中等耐受型,轻度遮光时不添加氮肥(S₁F₀)和轻度氮添加(S₁F₁)及全光照时轻度氮添加(S₀F₁)为适于幼苗生长的光氮组合。研究发现,光环境是影响黄檗幼苗光合作用和更新的主导因子,但黄檗苗期能耐受一定的遮阴胁迫;光照不受限制时,适当增加氮肥有利于黄檗幼苗生长;光照受限(重度遮光)时,施氮则抑制叶片叶绿素合成,降低了幼苗光能利用率,不利于其生长。     

IV型限制酶ScoMcrA中SRA结构域介导的二聚体化对硫结合结构域功能的影响机制

[背景] 部分细菌的DNA骨架会发生磷硫酰化修饰,硫结合结构域（Sulfur Binding Domain,SBD）可以特异性识别这种生理修饰。与绝大多数SBD-HNH双结构域核酸酶不同,ScoMcrA的SBD和HNH结构域中间插入了一个特异性识别5-甲基胞嘧啶（5mC）修饰DNA的SET and RING-Associated （SRA）结构域。晶体结构显示,单独的SBD是单体,而SBD-SRA是双体。[目的] 探究ScoMcrA中SRA结构域的存在对SBD识别硫修饰DNA的影响及影响方式。[方法] 凝胶迁移实验（Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA）比较SBD、SBD-SRA对硫修饰DNA结合力的差异;对参与SBD-SRA二聚体化的关键氨基酸残基突变,并检测点突变对SBD-SRA蛋白二聚体化及结合硫修饰DNA的影响。[结果] 相较于SBD结构域,SBD-SRA双结构域对磷硫酰化修饰DNA的结合能力明显增强。对SBD-SRA双体互作界面进行单点突变基本不影响其对硫修饰DNA的结合,当二聚体化界面连续的L₂₆₁LGET₂₆₅突变成A₂₆₁AAAA₂₆₅时,突变体对硫修饰DNA的结合力下降到与SBD相似的水平。[结论] 根据EMSA实验结果可以初步判断,SRA结构域介导的SBD-SRA双体化能增强SBD对硫修饰DNA的结合力;L₂₆₁LGET₂₆₅是SRA结构域上影响SBD对硫修饰DNA结合力的关键氨基酸位点。     

蓖麻蚕rDNA核骨架结合元件SAR的检测和特征分析

采用二碘水杨酸锂盐 (LIS)制备细胞核骨架 ,Southern杂交法检测与细胞核骨架结合的rDNA片段 ,发现蓖麻蚕rRNA基因 5′非转录间隔区 (NTS)内存在一个很强的核骨架结合元件 .外切核酸酶Ⅲ消化限定表明 ,该SAR位于SacⅡ -EcoRⅠ限制酶片段内 ,长度约 1kb .经DNA顺序分析表明 ,该片段AT碱基富集 ,A +T >70 % ,含有拓扑异构酶Ⅱ保守序列和ATATTT结构花式 ,以及酵母自主复制序列(ARS)的同源序列 ,该SAR内含有 (AT) ₁₈序列已证明是核酸酶S1的超敏感位点 ,这种核酸酶S1的超敏感性可能是SAR元件的信号特征之一 .     

胰RNA对瘤细胞作用的研究——胰RNA对离体瘤细胞的杀伤作用及其有效组分的初步探讨

在体外培养瘤细胞的实验中,胰RNA提取物不仅对艾氏腹水癌细胞而且对其他瘤细胞(S₁₈₀、P₃₈₈、H₂₂)也具有杀伤作用。在胰RNA提取物中,对瘤细胞具有杀伤作用的活性物质不是外源性凝集素样多糖类或能透过半透膜的低分子化合物,而是具有一定二级结构的低分子RNA。     

氧化铈纳米颗粒种子引发对盐胁迫下辣椒种子萌发及幼苗生长的影响

氧化铈纳米颗粒(CeO₂NP_S),因具有较强的自由基清除能力和抗氧化酶特性,已被证明可提高植物的耐盐性,但其对辣椒种子引发作用和机制尚不明确。为揭示CeO₂NP_S种子引发处理辣椒对盐胁迫下的萌发及幼苗生长的影响,以辣椒品种(Capsicum annuum)茂蔬360为试验材料,设置了7个CeO₂NP_S浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L^-1),以未引发处理组为对照,研究不同浓度CeO₂NP_S种子引发处理后对盐胁迫下辣椒种子萌发、幼苗生物量和生理生化指标的影响。结果表明:(1)0.5 mmol·L^-1 CeO₂NP_S种子引发处理后的种子,其可溶性蛋白质、脯氨酸含量和过氧化氢酶(CAT)活性、抗坏血酸(AsA)含量和AsA/DHA比值显著提高,超氧阴离子(O₂^-)含量显著降低; 盐胁迫下,该处理种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数最大。(2)0.4 mmol·L^-1 CeO₂NP_S种子引发处理的幼苗在盐胁迫下的鲜重、干重和根长最大,幼苗的可溶性蛋白质、AsA含量和AsA/DHA比值均显著提高。综上认为,CeO₂NP_S引发处理不仅可通过降低种子水势、促进贮藏物质代谢和提高抗氧化能力提高种子在盐胁迫下的发芽率,还可在苗期通过增强蛋白合成和抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)促进盐胁迫下幼苗的生长。     

核酸酶BN及SN基因的克隆和序列分析

分别从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurcus)中提取染色体DNA,经HindⅢ酶解后PCR扩增获得Barnase(核酸酶BN)基因和Staphylococcal Nuclease(核酸酶SN)基因,并克隆到质粒pGEMTZ-f(+)上。序列分析表明,核酸酶BN的核苷酸序列与已发表的序列有99.3%的同源性,而与据此推测的氨基酸序列完全一致。核酸酶SN基因的核苷酸序列与已发表     

蓖麻蚕rDNA的十字结构

单链核酸酶——S1酶在超螺旋pBR322上有专一的切点。这是因为在pBR322超螺旋分子上邻近的反向重复顺序所形成的十字结构具有单链区能为S1酶作用。真核细胞基因——蓖麻蚕rDNA的完整重复单位插入pBR322所组建的质粒pARⅢ,其超螺旋分子的顺序上也有S1敏感区。用S1酶和PstⅠ酶双酶切可以产生特定长度的片段。pARⅣ是带有pARⅢEeoRⅠ(2)-BamHⅠ(2)片段的次级克隆,超螺旋pARⅣDNA经S1酶和PstⅠ酶双酶切所显示的S1酶切点与pARⅢ一致。由于对S1酶的相对敏感度不同,在pARⅢ和pARⅣ分子中原有的pBR322上的S1酶切点被掩盖。真核细胞DNA的十字结构在染色质水平上的功能意义有待进一步探讨。     

苜蓿花叶病毒沉降系数的分析

苜蓿花叶病毒是一种多组分病毒,提纯的病毒样品中有五种不同形态的颗粒。在白三叶草分离物中的苜猪花叶病毒的鉴别研究中,使用超速离心分析法进行了该病毒的理化特性分析。在分析测试中我们使用了Schlieren光路与紫外吸收光路对照,二次变速法,配合适当的样品浓度和离子强度。获得了较为理想的可供分析计算的五个样品组分的扫描记录图,并得到了该五种组分颗粒的沉降系数S值,分别为S_zow=98s S₂₀₀₂=82s S₂₀₀₁=72s S_20w<     

模拟不同降雨时间格局下喀斯特垂直异质生境对桢楠幼苗光合和生长的影响

由于岩石裸露、地表破碎、坡度陡峻、洼地土壤堆积等因素的共同作用,喀斯特区域土壤具有明显的不连续性和高度异质性,土壤侵蚀往往较为严重。喀斯特地区高度异质性的生境为植物提供了不同的水分、肥料、空气和空间,对植物的生长和生理具有显著影响。在全球气候变化下,降雨时间格局的改变可能将进一步加剧喀斯特的生境异质性。桢楠是我国特有的国家二级保护树种,虽然它只零星分布在喀斯特地区,但由于它能在岩石间生长得很好,仍被认为是一种可能的适宜树种。以二年生桢楠（Phoebe zhennan S.Lee）幼苗为研究对象,研究总降水量相同条件下两种降雨时间格局（I_2d：2 d降雨间隔;I_19d：：19 d降雨间隔处理）和三种垂直异质小生境（S₀：无石全土,S_1/2：半石半土,S_3/4：多石少土）对其光合生理和生长的影响。结果显示：（1）在I_2d条件下,桢楠幼苗的光合速率在半石半土生境（S_1/2）下最大,且有较大的地径和株高;而在I_19d条件下,桢楠的光合和生长（株高和地径）均随着岩溶裂隙层的增厚逐渐减小。（2）在全土生境（S₀）下,降雨时间格局的改变并不影响桢楠的光合和株高,而在有岩溶裂隙层的生境下（S_1/2和S_3/4）,降雨时间间隔的延长会抑制桢楠的光合和株高及地径的生长,提高气孔密度,且这种抑制或促进作用会随着岩溶裂隙层的增厚而加剧。研究表明,在降雨间隔时间短,降雨均匀充足时,有少量的岩溶裂隙能够促进桢楠的生长和光合,但降雨间隔时间延长后,这种作用丧失。另一方面,在土壤相对较厚时,降雨时间间隔的改变对桢楠的光合和生长影响不显著,但岩溶裂隙层的增加,加剧了降雨时间间隔增大对桢楠光合的负面影响。