单克隆抗体生产的新时代

由fd噬菌体与质粒重组载体噬菌粒(phagemid)构建大容量,高效筛选的表面表达抗体基因片段文库,经突变、模仿体内B细胞亲和力成熟过程(affinity maturation)以免疫亲和层析筛选高亲和力特异抗体片段.取代单克隆抗体,应用于免疫分析诊断.     

噬菌体抗体库技术的研究进展

从显示在丝状噬菌体表面的重组抗体库中选择抗体的方法已成为获得试剂、诊断及治疗的重要手段。本文介绍该技术的原理、发展及运用,但着重描述如何利用细胞筛选、改进洗脱条件、增加库容及进一步筛选以获得高亲和力抗体的方法。     

具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1二硫键稳定Diabody的制备

目的：对天然噬菌体抗体库进行筛选并对抗体进行体外亲和力成熟,获得高亲和力人源性抗PD-L1抗体,然后对该抗体进行二硫键稳定改造,获得具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1的二硫键稳定Diabody。方法：首先以PD-L1重组蛋白为抗原在天然噬菌体Fab抗体库中筛选Fab抗体,其次分析结合能力较好的抗PD-L1的Fab抗体可变区基因中的热点,通过对轻链、重链CDR3区的7处热点随机突变构建噬菌体抗体突变库,从中筛选出亲和力得到提高的抗体。最后在抗体骨架区引入两个二硫键,构建二硫键稳定的抗PD-L1的ds-Diabody,并在毕赤酵母GS115中进行表达。结果：该方法筛选获得了6株特异性抗PD-L1噬菌体Fab抗体,对结合能力较好的其中一株抗体CDR3区的热点进行随机突变,成功构建库容为1.14×10⁸ CFU/mL的噬菌体抗体突变库,并从中筛选出亲和力提高约6倍的噬菌体抗体突变株。对该抗体骨架区进行二硫键引入,成功构建与表达二硫键稳定的ds-Diabody。结论：构建的ds-Diabody比Fab抗体与PD-L1结合亲和力高、稳定性好,为药物开发、肿瘤治疗等研究P...     

噬菌体抗体技术

抗体可变区的重键基因及轻链基因与线性噬菌体的包膜蛋白蛋白基因重组后,可以在噬菌体表面表达形成具有活性的抗体片段。通过抗原的直接筛选,可以分离得到特异性强,亲和力高的抗体分子,包括人抗体。本文就噬菌体抗体文库的构建,噬菌体抗体的分离及其应用作了简要介绍。     

丝状噬菌体表面呈现技术

对丝状噬菌体的结构、基因组及生命周期的深入认识,是丝状噬菌体表面呈现技术建立和发展的基础,可将外源基因片段插入噬菌体的基因Ⅲ（ｇ３）或基因Ⅷ（ｇ８）的先导序列的紧下游,使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式呈现有噬菌体表面外壳蛋白ｇｐ３或ｇｐ８的Ｎ端,这样的呈现常能使表达的多肽保持生物活笥,据此可用活的噬菌体直接方便,高效率地筛选目的基因或检测该基因产物的活性,这技术已被用于抗体基因库,ＣＤＮＡ     

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因,连接至噬菌粒pCANTAB 5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coli HB2151,IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv,为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。     

鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的制备及分析

利用噬菌体抗体库筛选技术获得抗雄性特异性抗原的噬菌体Fab抗体,首次采用雄鼠脾细胞对鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体库进行3轮亲和富集和2轮雌鼠脾细胞吸附,对筛选后特异性噬菌体Fab抗体进行ELISA分析,重组率鉴定及基因测序分析。结果显示,5次筛选后的15个菌落中有9个能产生抗雄性特异性抗原特异性噬菌体抗体,噬菌体Fab抗体的基因重组率为60%,E5克隆的重链、轻链可变区序列分别属于VH1和VκⅣ基因家族,这为挑选出高亲和力的抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体奠定了实验基础,将推进雄性特异性抗原及其抗体的研究进程,并为性别控制研究开创新途径。     

噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展

噬菌体展示技术已成为制备高亲和力抗体的强有力的工具。而噬菌体抗体库的筛选是在获得高亲和力抗体过程中很关键的一个环节。总结了针对不同复杂程度的抗原所须采用的不同筛选方法,并简单介绍了高通量筛选的优势。     

抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ...     

TNF-α纳米抗体的筛选、表达及特异性检测

目的:构建肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)纳米抗体的噬菌体文库,筛选并表达与TNF-α具有亲和特异性的纳米抗体。方法:(1)利用TNF-α免疫羊驼,提取外周血淋巴细胞总RNA,构建噬菌体文库;多次淘洗筛选到与TNF-α有亲和力的克隆。(2)通过ExPASy分析其分子量和亲疏水性等理化性质,并将筛选得到的VHH基因在大肠杆菌E.coli DH5α中表达。(3)表达的Nb_(TNF-α)蛋白质经过Ni金属螯合亲和层析纯化,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测蛋白质的抗原特异性和亲和力。结果:(1)通过噬菌体文库的构建和淘洗,筛选到8个与TNF-α有亲和力的VHH基因片段。(2)通过软件预测,这8个Nb_(TNF-α)蛋白均为亲水性蛋白,其分子量为19.6～20.1kDa;在大肠杆菌中重组表达这8个抗体蛋白。(3)ELISA检测结果表明,有5株纳米抗体Nb_(TNF-α)-1、Nb_(TNF-α)-2、Nb_(TNF-α)-3、Nb_(TNF-α)-4和Nb_(TNF-α)-5能与TNF-α特异性结合。结论:成功筛选并表达了5株具有TNF-α特异性的纳米抗体,可能成为抗TNF-α的候选药物。     

噬菌体抗体库技术制备高亲和力人抗体

噬菌体抗体库技术的基本原理是将全套抗体可变区基因组装到丝状噬菌体表达载体内 ,与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因融合并表达到噬菌体表面 ,以固相化的抗原作配基 ,通过吸附 洗脱 扩增的富集过程 ,筛选到与抗原特异结合的抗体克隆 ,并得到相应的抗体可变区基因。因此噬菌体抗体库技术可以被认为是体内抗体生成过程的模拟 ,首先建立足够多样性的抗体库 ,然后通过免疫亲和筛选即可能得到针对任何抗原的人抗体。该技术省时省力 ,无...     

人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7噬菌体抗体库的构建

构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。     

人源抗EPO基因工程抗体重链可变区的克隆和鉴定

利用噬菌体抗体显示技术筛选 EPO的人源抗体 ,得到了抗 EPO的人源抗体的重链基因。此抗体基因在噬菌体表面呈现的抗体分子具有良好的抗体活性和特异性。为制备完整的、具有更高亲和力的抗体打下了基础。     

链替换技术提高噬菌体抗体亲和力的研究进展

高亲和力抗体基因的克隆是噬菌体抗体在基础研究、临床诊断治疗研究等重要领域中应用的基础。链替换技术已逐步广泛用于噬菌体抗体的性能改造。该技术不仅可以促进噬菌体的体外亲和力成熟,提高抗体亲和力,有助于低剂量抗体达到实际应用所需要的抗原结合效应,拓宽抗体的应用开发前景,而且可应用于减少抗体人抗鼠抗体反应,分析重链或轻链基因对抗原抗体结合的影响,有助于较好的理解免疫化学。就链替换的原理、策略及其应用进行综述。     

噬菌体抗体库技术研究进展

抗体研究可分多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段。特别是噬菌体抗体库 (ｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙ)技术[1 ]可达到不经免疫制备人源性小型化基因工程抗体。这一技术将抗体基因的克隆与表达融为一体 ,是一种新的基因操作技术 ;同时将识别抗原与再扩增能力结合在一起 ,是一种高效的表达和筛选抗体的新一代技术。1　噬菌体抗体库技术的基本原理[2 ,3 ]噬菌体抗体库技术是将抗体ＶＨ和ＶＬ基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ (ｃｐⅢ )或Ⅷ (ｃｐⅧ )基因随机重组 ,继而感染大肠杆菌 ,经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Ｆａｂ…     

抗乙型肝炎病毒表面抗原T7噬菌体抗体库的构建

构建T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体.从抗-HBs阳性患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第1条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接.体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库.以乙型肝炎病毒表面抗原进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性.所建抗体库库容为1.53×107,扩增后初级库滴度为2.42×1010pfu/mL.以乙型肝炎病毒表面抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与HBsAg抗原特异结合的噬菌体抗体,成功构建了抗HBsAg蛋白T7噬菌体抗体库.     

噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示技术（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）为制备高亲和性抗体提供了有力的工具。噬菌体抗体库的筛选是其中关键的环节,为了提高筛选效率,用包被在固体表面的抗原进行筛选的传统方法不断地被改进,如宿主菌直接洗脱和双层膜筛选系统和抗抗体替代抗原筛选系统。将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染筛选系统。     

EGFRvⅢ胞外区基因重组腺病毒的构建及单域抗体的制备北大核心CSCD

本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒,并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库,筛选和制备EGFRvⅢ胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增EGFRvⅢ胞外区基因,并连接pAdTrack-CMV质粒载体,转化含有pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183感受态细胞,获得同源重组质粒转染HEK293A细胞,得到表达EGFRvⅢ胞外区蛋白的重组腺病毒。利用重组腺病毒免疫双峰驼,构建EGFRvⅢ胞外区特异性噬菌体单域抗体库,并以EGFRvⅢ蛋白为筛选抗原,对其进行筛选,对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明获得了表达EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒。构建得到的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库的库容为1.4×109;经过3轮富集和筛选,通过噬菌体ELISA筛选出31个与EGFRvⅢ胞外区蛋白结合的阳性克隆,并对OD450值较高的重组单域抗体E14进行了表达和纯化。经ELISA鉴定,重组单域抗体E14可与EGFRvⅢ胞外区蛋白产生抗原抗体结合反应,具有较高的亲和力。说明制备的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性,且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原活性和免疫学反应性,为今后以EGFRvⅢ为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的实验依据。     

表位九肽库的构建及人Ⅳ型胶原酶特异结合肽的筛选

将人工合成的编码九肽的随机序列DNA片段克隆进丝状噬菌体表达载体FUSE5,经多次电击转化和表达,获得肽段与噬菌体pⅢ蛋白融合并展示在噬菌体表面的随机序列九肽表位肽库。库容量达10 10个克隆。以Ⅳ型胶原酶为靶蛋白,采用亲和纯化筛选模式,从中筛选出Ⅳ型胶原酶结合肽。进一步ELISA检测筛选出与Ⅳ型胶原酶特异结合的20个阳性克隆。序列分析发现一组肽含有WDXXD的共同序列,一组含有WVGXXR的共同序列。其中WDXXD的序列与Ⅳ型胶原酶单链抗体可变区序列同源。结果表明,多肽库是筛选蛋白特异结合肽的有力工具,表位九肽库的构建和筛选方法的建立为进一步应用筛选具有高亲和力的特异结合肽奠定了基础。     

可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析

应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,一个与肿瘤发生、侵袭和转移相关原癌基因产物)特异性、高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CH1、CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,构建Fab次级抗体库.经细胞筛选和固相筛选,获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,在25ku和27ku出现预期大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、免疫沉淀、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与S114和MKN45细胞膜上的Met胞外区特异性结合,而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显示,Fab能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG结合,并进入细胞内,抑制Met阳性细胞的生长,揭示该抗体能够与Met特异性结合,并且被细胞内化.该抗体有望成为肿瘤临床诊断或治疗的候选分子.