在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

重组质粒PYP22带有一从酵母基因文库分离到的4.6 kb DNA片段,此片段含有脯氨酸(Pro)合成途径必须的基因B(ProB)。用BamHⅠ酶解PYP22,回收ProB基因,重组入pGA471的Bg Ⅲ切口,形成含有ProB的双质粒载体PBYU4。pBYU4含有能在植物中表达的新霉素磷酸转移酶基因Ⅱ(NPT—Ⅱ),可做转基因植株的筛选标记。借助于辅助质粒pRK2013,pBYU4经过三亲结合转移到农杆菌LAB4404,在含有四环素12.5μg/ml、链霉素100μg/ml和利福平50μ/ml加的AB培养基上筛选出转接合子。提取筛选得到的农杆菌总DNA,用ECoR 1酶解,1％琼脂糖电泳,Southern转移DNA到硝酸纤维素膜上。用α—~(32)P-dCTP标记的ProB片段,与转移好的硝酸纤维素进行Southern杂交。Southern杂交证明含有ProB基因的农杆菌,在加有乙酸丁香酮(acetosyringone)125μg/ml和章鱼碱(octopine)125μg/ml的MS液体培养基中,诱导过夜。用叶圆片法转化革新1号烟草(Nicotana tabacum var.Gexin No.1),叶片与菌液共培养2～5d。从叶片分化再生出的芽转移到含有卡那霉素(K_m)80μg/ml、6—苄基腺嘌呤(6BA)1μg/ml和头孢氨噻腭钠(Cef)500μg/ml的MS培养基,筛选3周,将绿色的芽转移到含l％NaCl,6BA 1μg/ml和Cef 500μg/ml的MS培养基,进行复筛。测定经过这样筛选的再生芽的NPT—Ⅱ活性。     

酵母pro2基因转化紫云英的研究

用外植体－农杆菌共培养法将酵母脯氨酸合成酶基因２（ｐｒｏ２）导入豆科牧草紫云英,获得转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析检测到转化植株基因组中存在外源ＤＮＡ的同源顺序,证明酵母ｐｒｏ２基因已整合到紫云英细胞基因组中。转化植株具有强的ＮＰＴⅡ酶活性,而对照植株呈阴性反应。在含０．５％ＮａＣｌ的培养基上,紫云英植株内游离脯氨酸含量增高,一些转化植株叶片内游离脯氨酸含量显著高于对照,而且耐盐性有所     

低能离子束介导外源基因转化烟草的研究

以烟草ＮＣ－８９种子为材料,用显微扫描电镜（ＥＳＭ）和电子自旋共振（ＥＳＲ）波谱仪研究氮离子束对烟草种子表面的刻蚀作用及能量沉积产生自由基的间接效应,为离子束介导转移外源基因提供了形态结构依据。将烟草种子用２０Ｋｅｖ的氮离子束处理后,浸入含有ＰＢⅠ１２１质粒的缓冲介质中,在含有卡那霉素１００ｍｇ／Ｌ的ＭＳ０培养基上继代筛选,得到３株抗性植株。取抗性植株的叶片,经组织培养后得到再生抗性植株。经过ＰＣＲ及ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明外源基因已转入烟草。     

高效的酵母完整细胞转化法

以穿梭质粒PYES2转化酿酒酵母H158,用二硫苏糖醇（DTT）和处理酵母细胞,变性单链鱼精DNA（ssDNA）为质粒DNA的携带体;转化率比普通酵母完整细胞转化法提高200倍,可达8．3×104个转化子/μg质粒DNA。     

酵母pro 2基因转化紫云英的研究

用外植体一农杆菌共培养法将酵母脯氨酸合成酶基因2(pro 2)导入豆科牧草紫云英,获得转基因植株。Southern blot分析检测到转化植株基因组中存在外源DNA的同源顺序,证明酵母pro 2基因已整合到紫云英细胞基因组中。转化植株具有强的NPT Ⅱ酶活性,而对照植株呈阴性反应。在含0.5%NaCl的培养基上,紫云英植株内游离脯氨酸含量增高,一些转化植株叶片内游离脯氨酸含量显著高于对照,而且耐盐性有所提高。转化植株移栽到土壤中开花结实,收获到R_1代种子。     

黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆及其在酵母中的表达

以A．niger TCCC41013总RNA为模板,通过RT-PCR扩增含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因pep,将其克隆到pUCm-T载体上进行测序。测序结果表明基因全长1581bp,共编码526个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽序列和504个氨基酸的成熟肽序列。通过生物信息学方法对蛋白质的理化性质进行分析预测,脯氨酸蛋白内肽酶等电点为4．43,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸羧肽酶S28家族。以重组质粒pUCm．T-pep为模板,通过PCR扩增去除自身信号肽的pep,构建毕赤酵母表达载体pPIC9-peP,电转酵母宿主菌GS115。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为60000Da左右,酶特异性底物法测定酶活力最高可达2275．4mU／mL。     

中间载体pBz6102的构建及CAT基因在转化烟草中的表达

来源于细菌的新霉素磷酸转移酶基因(NPT),氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)以及来源于昆虫的荧光素酶基因等都是用于研究根癌农杆菌转化植物的良好标记。我们利用氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和来源于Ti质粒T-区DNA的tmr基因,构建了中间载体pBZ 6102,并通过植物基因工程载体pGV 3850,将氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和tmr基因引入了植物细胞,并测到了表达,在抗氯霉素植物中测到了氯霉素乙酰转移酶活性。中间裁体pBZ 6102上还有Pst Ⅰ,Xba Ⅰ等单一的限制性内切酶位点,外源基因极易插入。转化植物F_1代的种子抗性分析表明,80%左右的种子都能在含氯霉素的培养基上正常萌发,它们的幼苗中都有氯霉素乙酰转移酶活性,证明CAT基因通过了减数分裂稳定地保留在植物细胞的基因组内。     

草酸氧化酶基因转化烟草的研究

为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV 35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,进一步对PCR产物测序表明OxO基因已整合进烟草基因组中。在对草酸的耐受性实验中,转基因烟草对草酸的抗性明显高于未转化烟草。     

褪黑素合成酶基因转化烟草及转化植株抗氧化系统变化

通过根癌农杆菌(含植物表达载体YXu55)介导的转化技术,将褪黑素生物合成酶-芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase,HIOMT)基因导入到烟草(秦烟95)中。对所获得的庆大霉素抗性烟草株系进行Southern blotting和RT-PCR分子生物学检测,结果表明,AANAT-HIOMT基因已成功地整合到烟草基因组中,并且可以在mRNA水平上进行转录。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定转化株系的褪黑素含量表明,转AANAT-HIOMT基因烟草株系的褪黑素含量均明显高于pZP122(不含AANAT和HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株,证明AANAT-HIOMT基因在转基因植株中的表达增强了褪黑素的合成能力。对不同株系抗氧化系统的部分指标进行了测定,并与其亲本对照植株比较,发现AANAT-HIOMT基因在转基因植物中的表达引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加,谷胱甘肽(GSH)浓度...     

农杆菌介导番茄铁载体蛋白基因(LeIRT2)转化烟草的研究

构建了含有目的基因(LeIRT2)的双元载体pYF840,并成功地将植物性内含子构建到筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)和gus报告基因中。利用农杆菌介导法,将铁载体蛋白(LeIRT2)基因导入革新一号烟草,PCR、PCR-Southern blotting及Southern blottlng检测结果显示,有3个烟草株系的基因组中整合了完整的铁载体基因(LeIRT2)。水培试验结果显示转基因株系1、3不但提高了植株的铁吸收能力,而且还促进了植株的生长,但转基因株系2却与对照无明显区别。     

甘露碱合成酶基因启动子调控的萤光素酶基因在转化烟草中的表达

利用我们自己分离的甘露碱含成酶基因启动子与萤光素酶结构基因、胭脂碱合成酶基因’3末端结构相拼构成一融合基因,并在带有此融合基因的中间载体PBZ7610插入Ti质粒T区的tmr基因,构成中间载体pBZ7621。利用改建的Ti质粒载体PGV3850,将萤光素酶融合基因引入了烟草植株,结果表明,萤光素酶融合基因在转化烟草中能表达。中间载体pBZ7610还带有PstⅠ,HindⅢ,XbaⅠ等多个单一的酶切位点,外源基因极易插入。利用中间载体pBZ7621,还可研究启动子在高等植物不同发育阶段中的功能特征。     

带内含子卡那霉素抗性基因双元载体构建及烟草转化

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率,将一个植物的内含子插入卡那霉素抗性基因编码区的N端。合成了一个带内含子的卡那霉素抗性基因。构建带该基因的植物双元表达载体pYP1202并转化烟草,受外植体在含卡那霉素50－200mg/L的选择培养基中抗性芽分化频率不受卡那霉素浓度影响,然而具有GUS活性的转化子占分化芽的比例却随着卡那霉素浓度的增加而升高。当培养基中加入500mg/L羧苄青霉素后受侵外植体产生的抗性芽频率比单一的卡那霉素筛选提高近1倍,高达91.4％,然而具GUS活性的转化子占抗性芽的比较仅有26.7％,在200mg/L的卡那霉素筛选下,比例升至93.3％。用带内含子卡那霉素抗性基因构建的植物表达载体转化植物可以减少假抗性芽的产生。     

烟草花叶病毒外壳蛋白的基因导入和转化烟株的再生

用T-DNA区携有嵌合的烟草花叶病毒外壳蛋白基因和卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)的土壤农杆菌株pACK403和pACK404与烟草品种SRl和斯佩特G-28单倍体无菌菌叶碟片进行共培养转化。转化后的叶碟片在含有头孢噻肟钠500毫克/升和卡那霉索300毫克/升的培养基上诱导芽,在含有头孢噻肟钠500毫克/升和卡那霉素100毫克/升的培养基上诱导生根。Nopaline测定,烟草花叶病毒外壳蛋白基因的表达检测、转化烟株对烟草花叶病毒侵染抗性的检测结果证明:用这种方法能可靠地将外源基因导入烟草,并能在转化烟株中表达。再生得到的转化烟株在烟草花叶病毒强感染情况下能延迟病症表现4—25天。     

烟草花叶病毒运动蛋白基因的cDNA克隆、序列测定及植物转化

植物病毒侵染宿主植物的一个重要过程是通过它在宿主体内的转移和传播,产生病害。植物病毒在宿主体内的转移主要有两种方式,一种是通过植物维管组织进行的系统转移,另一种是植物病毒在宿主细胞之间的转移,这种转移是通过植物细胞的胞间连丝实现的。实验表明,病毒自身编码的一种蛋白参与了这个转移过程,对烟草花叶病毒(TMV)而言,这种蛋白就是分子量为30kDa的运动蛋白。     

红豆越桔VviDREB1基因转化烟草的研究

通过构建pVB4215植物双元表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,研究VviDREB1在植物体中的异源表达特性.结果显示,实验获得了25个Hyg抗性株系,经过PCR、RT-PCR和GUS组织化学染色检测及Hyg基因的PCR复检等多点验证,证实表达载体边界内序列完整地整合到2个烟草株系的基因组中.转基因烟草株系在4℃低温处理20 h后,恢复生长5 h,叶片光系统PSⅡ抗寒性分析结果表明,转基因植株的叶片快速叶绿素荧光曲线OJIP各点数值高于对照植株,VviDREB1基因能够显著提高烟草的荧光产量,最大光化学效率Fv/Fm和以吸收光能为基础的性能指数PIABS较对照高,说明VviDREB1对保护植物组织细胞内光合系统PSⅡ有明显的作用,转VviDREB1基因烟草对低温有一定的忍耐能力.     

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室袁磊。刘学群。王春台利用已克隆的1个甲基茉莉酸（MeJA）诱导的糖基转移酶（GTs）基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,其长度约为1．4kb。用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP—GUS,通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38后,     

高效烟草遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

以烟草无菌茁叶片为外植体,通过根癌农杆菌LBA4404介导法,将Thamnatin基因导人烟草中,经梯度卡那霉素(Kana-mycin,Km)筛选,获得可在含75mg／L、100mg／L Km选择生根培养基上再生的抗性植株,其中部分Km抗性植株经PCR检测为阳性,转化率为31．3％,初步鉴定已成功地建立了烟草遗传转化系统,为进一步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况奠定基础。