大肠杆菌yijP侵袭蛋白诱导人脑微血管内皮细胞凋亡

为研究大肠杆菌的脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的功能,将yijP基因（1．04kb）克隆到pQE30表达载体,构建表达产物为N末端带有6个组氨酸（His）序列的yijP汇合蛋白,以M15（pREP4）为受体菌,大量表达（His）6-yijP汇合蛋白,利用Ni—NTA亲和层析纯化汇合蛋白,将经透析法复性的一定浓度的（His）6-yijP蛋白加入到体外培养的人脑微血管内皮细胞中,结果显示yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞有较强的细胞毒作用：在相差显微镜下可观察到细胞皱缩、胞膜呈泡状膨出,随着时间延长细胞逐渐脱落;荧光显微镜下可见细胞核呈现为致密团块状或圆形浓染颗粒状,呈凋亡样改变：DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带;流式细胞仪显示在正常二倍体峰之前出现一个亚二倍体峰;Western印迹可检测到caspase-3的活性片段。这些现象均出现在yijP蛋白作用于人脑微血管内皮细胞的16h之后,提示在大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞过程中,yijP蛋白可能起到诱导脑微血管内皮细胞迟发性凋亡的毒素作用。     

内质网应激条件下血管内皮细胞生长因子在人脑微血管内皮细胞中的表达

为观察内质网应激条件下血管内皮细胞生长因子的表达情况,用不同浓度的衣霉素处理体外培养的人脑微血管内皮细胞,建立内质网应激模型,采用RT—PCR、蛋白质免疫印迹以及免疫细胞化学的方法检测了细胞内血管内皮细胞生长因子的表达。结果发现血管内皮细胞生长因子在人脑微血管内皮细胞中存在一定的表达;内质网应激可诱导血管内皮细胞生长因子表达升高,随着衣霉素浓度的增高,血管内皮细胞生长因子的表达逐渐增加,与mRNA水平相比,血管内皮细胞生长因子蛋白量的增加更明显。实验结果提示人脑微血管内皮细胞中存在血管内皮细胞生长因子自分泌,血管内皮细胞生长因子可能是内质网应激的靶基因。     

木犀草素对高糖诱导的心肌微血管内皮细胞损伤的影响及机制

目的:探讨木犀草素对高糖诱导的心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)损伤的影响及其可能调控机制。方法:消化法分离大鼠CMECs,将原代CMECs随机分为4组:低糖组、低糖+木犀草素组、高糖组和高糖+木犀草素组。低糖+木犀草素组和高糖+木犀草素组分别加入30μmmol/L的木犀草素孵育24 h,低糖组和高糖组分别加入同等体积的DMSO孵育24 h。CCK-8实验检测CMECs增殖;Tunel法检测CMECs凋亡;Transwell检测CMECs的迁移能力;Western blot检测PKC-βⅡ的表达。结果:与低糖组和低糖+木犀草素组相比,高糖组CMECs增殖能力显著降低(0.341±0.018,P0.05),CMECs凋亡显著增加(P0.05),CMECs迁移能力显著降低(116±12.2,P0.05),PKC-βⅡ的表达显著增加(P0.05);与高糖组相比,高糖+木犀草素组CMECs增殖能力显著增加(0.550±0.023,P0.05),CMECs凋亡显著减少(P0.05),CMECs迁移能力显著增加(169±7.3,P0.05),PKC-βⅡ的表达显著降低(P0.05)。结论:木犀草素可能通过抑制PKC-βⅡ激活减少高糖诱导的心肌微血管内皮细胞损伤。     

ERM蛋白在微血管内皮细胞通透性调控中的研究进展

埃兹蛋白(Ezrin)/根蛋白(Radixin)/膜突蛋白(Moesin)(ERM)是细胞膜与胞内骨架的连接蛋白,具有高度同源性。细胞外刺激因子可通过多种信号通路磷酸化ERM蛋白,使细胞骨架重构,从而调控微血管内皮细胞通透性,在感染、炎症、代谢异常等病理过程中发挥作用。ERM功能调节的一个重要环节就是其羧基末端苏氨酸残基磷酸化后引起ERM构象的改变,暴露的羧基末端尾部的肌动蛋白(actin)-细胞骨架结合位点;故通过ERM的桥接作用,可将肌动蛋白微丝与细胞膜相连,使血管内皮细胞屏障功能发生变化。目前已知能使ERM磷酸化的激酶有蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Rho相关激酶(ROCK),分别通过p38-MAPK、Rho/ROCK、PKC信号通路参与微血管内皮屏障功能的调控。本文旨在阐述ERM及其相关信号通路在微血管内皮细胞通透性调控中发挥的作用。     

香椿子正丁醇提取物通过激活Nrf2改善高糖引起的肾小球内皮细胞氧化应激

目的探讨香椿子正丁醇提取物(n-butyl alcohol extract of toona sinensis,NBAE)对高糖引起的肾小球内皮细胞氧化应激的影响及机制。方法分别以高糖(high glucose,HG)、HG+NBAE刺激人肾小球内皮细胞,采用DCFDA法检测细胞内活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)生成情况,Nitrate/Nitrite Colorimetric法检测细胞内NO的含量,Western blot检测Nrf2、NQO1及HO-1的蛋白表达,免疫荧光方法检测Nrf2、P47phox在细胞内的定位及表达。结果高糖刺激肾小球内皮细胞后出现氧化应激损伤,ROS升高,NO减少,p47phox表达量增高,Nrf2及下游蛋白NQO1、HO-1表达减少;NBAE可明显提高Nrf2的表达,并增加下游蛋白NQO1和HO-1的表达,从而抑制高糖导致的ROS升高,抑制p47phox的表达,并稳定NO的含量。结论NBAE通过激活Nrf2及其下游靶蛋白来改善高糖对肾小球内皮细胞造成的氧化应激损伤。     

毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌.为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长.利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆茼的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少.利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低.这些结果提示,在大肠杆茼K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制.     

祛湿化瘀方通过调节AMPK活性改善高脂饮食诱导的实验性脂肪肝肝脏脂肪代谢

目的：研究祛湿化瘀方对高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝AMPK蛋白活性及其相关脂肪代谢靶蛋白活性的影响,以探讨该方防治实验性脂肪肝的作用机制。方法：采用高脂饲料饮食诱导大鼠脂肪肝模型,造模大鼠给予高脂饮食4周后,按随机数字表随机分为模型组及祛湿化瘀方组,分别灌胃给予饮用水及中药祛湿化瘀方4周。实验8周末取材后观察：1）肝组织三酰甘油（Triglyceride,TG）、游离脂肪酸（Free Fatty Acid,FFA）含量,2）肝组织病理变化（HE染色、油红染色）,3）肝组织腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-Activated K inase,AMPK）及磷酸化AMPK、肝组织总蛋白及核蛋白固醇调节元件结合蛋白-1 c（Sterol Regulatory Element Binding Protein-1 c、SREBP-1 c）、肝组织总蛋白及核蛋白碳水化合物反应元件结合蛋白（Carbohydrate Response Element Binding Protein、ChREBP）含量、肝组织乙酰辅酶A羧化酶（Acety1 CoA Carboxylase,ACCa-se）及磷酸化ACC蛋白含量,4）肝组织AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、ACCα、SREBP-1 c及ChREBP基因表达水平。结果：1）模型组肝组织TG、FFA含量显著升高,肝组织出现明显大泡样脂肪变性;模型组肝组织AMPK蛋白磷酸化水平降低、核蛋白SREBP-1与ChREBP表达增加、ACC蛋白磷酸化水平降低蛋白活性升高。2）祛湿化瘀方组肝组织TG、FFA含量较模型组显著降低,肝组织炎症及脂肪变性程度减轻;祛湿化瘀方能显著升高肝组织AMPK、ACC蛋白磷酸化水平、降低核蛋白SREBP-1及ChREBP含量。结论：祛湿化瘀方通过调节AMPK活性及其相关靶蛋白活性改善高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝肝脂肪代谢,这可能是该方有效防治实验性脂肪肝的重要作用机制之一。     

大肠杆菌侵袭基因缺失突变株与人脑微血管内皮细胞的相互作用

ibeA,ibeB,ibeC是与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)密切相关的基因,但迄今各基因的功能并不清楚。应用侵袭分析和免疫荧光技术分析了各基因的缺失突变型及野生型大肠杆菌对HBMEC的侵袭、细胞骨架与细胞间紧密连接的影响。结果显示：野生型菌大肠杆菌侵袭率为3.46％,而ibeA,ibeB,ibeC缺失突变株分别为0.54％、0．82％和0.73％：ibeA缺失突变型与野生型大肠杆菌作用相似,可引起HBMEC的细胞骨架蛋白分布改变,在细胞膜处呈明显的聚集,而ibeB和ibeC缺失突变株并未引起细胞骨架的明显改变;野生型和ibeA缺失突变型大肠杆菌可引起紧密连接结构的明显改变,而ibeB和ibeC缺失突变株对紧密连接结构的影响不明显。这些观察到的结果提示：ibeB和ibeC基因产物可能在调节细胞骨架和影响细胞紧密连接中起重要作用,而ibeA基因产物在其中的作用较小。     

白藜芦醇甙减轻高糖所致心肌微血管内皮细胞损伤的作用及机制研究

目的:探讨白藜芦醇甙在高糖处理的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用及其可能调控机制。方法:酶消法分离大鼠CMECs,高糖处理CMECs建立细胞损伤模型,实验随机分为6个组:对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、白藜芦醇甙组、高糖组(葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高糖+白藜芦醇甙组、高糖+白藜芦醇甙+3-MA(自噬抑制剂)组和高糖+雷帕霉素(自噬诱导剂)组。白藜芦醇甙组和高糖+白藜芦醇甙组分别加入10μmol/L的白藜芦醇甙孵育24 h,高糖+白藜芦醇甙+3-MA组加入10μmol/L的白藜芦醇甙和10μmmol/L 3-MA孵育24 h,高糖+雷帕霉素组加入100 nmol/L的雷帕霉素孵育24小时。CCK-8实验检测大鼠CMECs增殖;Tunel法检测大鼠CMECs凋亡;FITC-葡聚糖清除实验检测单层CMECs通透性;Western blot检测LC3Ⅱ和p62的表达。结果:与对照组和白藜芦醇甙组相比,高糖组CMECs增殖能力降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05),细胞通透性增加(P<0.05),LC3Ⅱ表达降低(P<0.05),p62的表达增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+白藜芦醇甙组和高糖+雷帕霉素组CMECs增殖能力增加(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05),细胞通透性降低(P<0.05),LC3Ⅱ表达增加(P<0.05),p62的表达降低(P<0.05);与高糖+白藜芦醇甙组相比,高糖+白藜芦醇甙+3-MA组CMECs增殖能力降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05),细胞通透性增加(P<0.05),LC3Ⅱ表达降低(P<0.05),p62的表达增加(P<0.05)。结论:白藜芦醇甙通过增加自噬减轻高糖处理的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤。     

肺微血管内皮细胞通透性调控的信号转导机制

肺微血管内皮细胞通透性增加是急性呼吸窘迫综合征等疾病的病理基础,多种信号转导系统参与其通透性调控,如细胞内Ca2 、蛋白激酶C、环磷酸腺苷、丝裂原激活蛋白激酶、小G蛋白.这些信号转导系统的激活和调控机制各异,并且相互关联组成复杂的信号网络.肺微血管内皮细胞中信号转导的相互作用将是研究方向之一.     

线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)通过AMPK/FOXO3a通路改善高糖导致的心肌细胞凋亡

目的:观察乙醛脱氢酶2(ALDH2)对高糖诱导的H9C2心肌细胞存活及凋亡的影响,并探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/FOXO3a信号通路在高糖导致的心肌细胞凋亡中的调控作用。方法:以30 mmol/L葡萄糖诱导培养H9C2心肌细胞48 h,经ALDH2激动剂Alda-1及AMPK抑制剂Compound C干预后,用MTT法检测细胞的存活情况,TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况,Western blot检测ALDH2、磷酸化AMPK和FOXO3a蛋白的表达水平。结果:与对照组相比,高浓度葡萄糖培养H9C2心肌细胞后,细胞的存活率显著降低、凋亡指数明显升高,磷酸化AMPK的表达水平明显上调,ALDH2和磷酸化FOXO3a的蛋白表达显著降低(P0.05)。ALDH2的激动剂Alda-1处理可显著提高高糖诱导的H9C2心肌细胞的存活率、降低其凋亡率,减少磷酸化AMPK的蛋白表达,增加ALDH2的表达和FOXO3a蛋白的磷酸化;而进一步采用AMPK的抑制剂Compound C处理,可显著抑制Alda-1对高糖诱导的H9C2心肌细胞的这些影响。结论:ALDH2的激动剂Alda-1对高糖诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用,可能与其激活AMPK,进而抑制心肌细胞FOXO3a的活性有关。     

水解南珠液抑制细胞自噬减轻人微血管内皮细胞氧化损伤

[目的]以人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cell-1,HMEC-1)为研究对象,采用H2O2诱导内皮细胞氧化应激,探讨南珠水解液对HMEC-1细胞氧化损伤的保护作用及机制。[方法]采用生化检验法检测南珠水解液作用后,HMEC-1细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量变化;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen,ROS)含量变化;采用透射电镜观察自噬体;采用免疫荧光实验检测细胞微管相关蛋白轻链3Ⅰ/Ⅱ(Microtubuleassociated protein light chainⅠ/Ⅱ,LC3Ⅰ/Ⅱ)表达变化。[结果]与氧化损伤组相比,不同浓度南珠水解处理组SOD活性显著增加,分别提高8.68%、24.99%和49.43%; GSH-PX活性无显著变化; MDA显著降低,分别降低36.99%、35.82%和60.25%;且给药组细胞内RO...     

桂皮醛激活血管内皮TRPA1防止高糖诱导的氧化应激保护血管内皮功能

目的:探索桂皮醛对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的影响及其对相关血管内皮功能损害的作用,初步分析其作用机制。方法:(1)制作高糖(30 m M)致人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤和血管组织损伤模型,并以低糖(5.5 m M)作为对照,高糖干预的HUVECs给予桂皮醛(10μM)或桂皮醛+TRPA1特异性拮抗剂(HC030031,10μM)进行干预,以DHE染色和DAF-2DA染色观察各组细胞超氧阴离子和一氧化氮(NO)水平;western blotting分析核因子E2相关因子2(Nrf2),内皮一氧化氮合酶(eNOS),磷酸化eNOS及P22~(phox)水平。(2)以TRPA1敲除(TRPA1~(-/-))及相应的野生型(Wild type,WT)小鼠分离胸主动脉进行体外培养,设低糖(5.5 m M D-葡萄糖)组、高糖(30 m M D-葡萄糖)组、高糖+桂皮醛(10μM)组,以微血管张力测定仪测定血管内皮依赖性舒张功能和非内皮依赖性舒张功能。结果:(1)桂皮醛可显著减少高糖介导的内皮细胞超氧阴离子的产生,防止NO水平下降,但上述作用可被HC030031所阻断。(2)桂皮醛可显著防止WT小鼠胸主动脉血管内皮依赖性舒张功能减退,但对TRPA1~(-/-)小鼠无上述作用。(3)桂皮醛剂量依赖性地上调Nrf2的表达,还可促进eNOS磷酸化,减少P22~(phox),上述作用均可被HC030031阻断。结论:桂皮醛激活TRPA1通过Nrf2信号通路可改善高糖介导的血管内皮细胞氧化应激水平,防止NO水平下降,改善血管内皮依赖性舒张功能。     

巨噬细胞炎症蛋白1α促进6T-CEM细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层

有研究表明,T细胞可能参与阿尔茨海默氏病(AD)免疫过程,但T细胞如何穿过血脑屏障内皮细胞紧密连接,到达脑内还不清楚。我们研究曾发现,AD病人外周血T淋巴细胞穿过人脑微血管内皮细胞(HBMEC)单层能力高于同龄正常人,其T淋巴细胞巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)表达明显增高。为进一步在体外研究促使T淋巴细胞穿过HBMEC单层的机制,选取重组人MIP-1α(rhMIP-1α)作用于HBMEC,同时选用高表达MIP-1α的人急性白血病T淋巴细胞(6T-CEM)作为模式细胞,与HBMEC共同温育。发现rhMIP-1α可促进6T-CEM细胞穿过HBMEC单层,并使HBMEC单层紧密连接结构发生改变。在6T-CEM细胞或rhMIP-1α与HBMEC单层单独温育过程中,均引起HBMEC单层CCR5表达变化。提示MIP-1α可能通过与HBMEC单层上CCR5相互作用介导T淋巴细胞穿过HBMEC单层。     

miR-20b-5p靶向MAPK1调控脑出血过程中脑微血管内皮细胞铁死亡

摘要 目的：探讨miR-20b-5p对氧糖剥夺（OGD）/Hemin处理的脑微血管内皮细胞（BMVEC）功能的影响及机制。方法：将BMVEC分为Control组、agomir-NC组、agomir-miR-20b-5p组、antagomir-NC组和antagomir-miR-20b-5p组。使用Lipofectamine 2000试剂对细胞进行相应的转染处理。BMVEC转染后，将BMVEC再分为Control组、OGD/Hemin组（O/H组）、OGD/Hemin+agomir-NC组（O/H+agomir-NC组）、OGD/Hemin+agomir-miR-20b-5p组（O/H+agomir-miR-20b-5p组）、OGD/Hemin+antagomir-NC组（O/H+antagomir-NC组）和OGD/Hemin+antagomir-miR-20b-5p组（O/H+antagomir-miR-20b-5p组）。Control组BMVEC正常培养，其他组BMVEC进行OGD/Hemin处理。MTT法检测BMVEC增殖，TUNEL染色检测BMVEC凋亡，Transwell检测BMVEC迁移。使用试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平。使用Iron Assay试剂盒检测Fe²⁺含量。通过qRT-PCR检测miR-20b-5p和MAPK1 mRNA水平。通过Western blot检测MAPK1、Bax、Bcl-2、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）蛋白表达水平。通过免疫荧光染色检测MAPK1的荧光强度水平。结果：与Control组和agomir-NC组比较，agomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平升高（P<0.05）。与Control组和antagomir-NC组比较，antagomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低（P<0.05）。与Control组比较，O/H组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低，细胞活力降低，TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，迁移数量降低，SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平升高，GPX4的蛋白表达水平降低，MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度升高（P<0.05）。与O/H组和O/H+agomir-NC组比较，O/H+agomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平升高，细胞活力升高，TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，迁移数量升高，SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低，Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平降低，GPX4的蛋白表达水平升高，MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度降低（P<0.05）。与O/H组和O/H+antagomir-NC组比较，O/H+antagomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低，细胞活力降低，TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，迁移数量降低，SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平升高，GPX4的蛋白表达水平降低，MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度升高（P<0.05）。结论：本研究表明上调miR-20b-5p通过抑制OGD/Hemin处理的BMVEC中MAPK1的表达从而抑制了铁死亡途径。     

氧化应激诱导内皮细胞凋亡microRNA表达改变的研究

目的:研究氧化应激诱导的内皮细胞micro RNA的表达变化。方法:ECM(Endothelial Cell Medium)培养人脐静脉内皮细胞,利用不同浓度双氧水(0μmol/L,200μmol/L,500μmol/L,800μmol/L)刺激24小时后应用流式细胞术检测其凋亡水平。提取细胞总RNA,利用实时定量PCR(Quantitive real-time PCR;q RT-PCR)检测micro RNA表达量变化,并利用生物信息学软件预测可能的靶基因。结果:加入不同浓度双氧水处理24 h后的内皮细胞总凋亡率均显著高于对照组,200μmol/L、500μmol/L和800μmol/L组的凋亡率分别为(13.31%vs 4.75%,35.9%vs 4.75%,89.75%vs 4.75%,P0.01)。200μmol/L的双氧水处理内皮细胞后,micro RNA的表达出现了明显的改变。其中mi R-92a、mi R-126的表达明显下调(P0.05),mi R-181a、mi R-217、mi R-34a和mi R-320的表达明显上调(P0.05)。靶基因预测显示mi R-320、mi R-92a可能调控多个和内皮细胞凋亡相关的基因表达。结论:在氧化应激诱导的内皮细胞凋亡中,mi RNA表达发生改变并可能参与调控内皮细胞功能。     

新生隐球菌胞外蛋白水解酶对脑微血管内皮细胞的作用

目的初步探讨新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶在新生隐球菌穿越血脑屏障致病过程中的作用。方法在含有成熟的脑微血管内皮细胞的培养皿中,分别加入胞外蛋白水解酶相关成分及其特异性抑制剂后,利用相差显微镜动态观察微血管内皮细胞形态学的改变;应用免疫组织细胞化学技术检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、微管相关蛋白（Tau-LRP）和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDL—LRP）表达的变化。结果①加入丝氨酸蛋白酶1h后可观察到内皮细胞开始收缩,面积变小,细胞间隙增宽,细胞收缩有时间依从性,至10h时仅为处理前的20％;加入丝氨酸蛋白酶＋抑肽酶后细胞形态学无明显变化（P〉0．05）。②加入隐球菌浓缩上清液1h后内皮细胞开始收缩,至6h时为原来的20％;加入菌株浓缩上清液＋抑肽酶后细胞形态学无明显变化（P〉0．05）。③丝氨酸蛋白酶使内皮细胞的MMP-9、Tau．LRP、LDL—LRP的表达上调,与对照组比较,有显著统计学差异（P〈0．01）。结论新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶可能通过上调MMP-9和（或）Tau—LRP、LDL—LRP的表达,诱导内皮细胞基质降解和细胞自身微管结构及紧密连接发生变化,最终导致血脑屏障通透性增加,菌体细胞穿越血脑屏障而致病。     

毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌．为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长．利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆菌的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少．利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低．这些结果提示,在大肠杆菌K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制．     

miR-29a通过调控PTEN表达对脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用研究*

目的:探讨miR-29a在脂多糖(LPS)诱导人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)损伤中的作用及机制。方法:构建LPS损伤HPMVECs模型。RT-qPCR检测miR-29a表达变化;试剂盒测乳酸脱氢酶(LDH)释放量;MTT和流式细胞术分别检测细胞存活率及凋亡率;Western blot测蛋白质表达水平;Microcosm、starBase、Pictar、TargetScan软件预测 miR-29a的可能靶基因,双萤光素酶实验验证miR-29a和PTEN的靶向关系。结果:使用LPS处理HPMVECs,显著降低细胞中miR-29a的表达和细胞存活率,诱导LDH释放量和HPMVECs凋亡率增加,上调细胞中PTEN、Bim蛋白表达,下调p-Akt/Akt、p-FOXO3a/FOXO3a表达 (P<0.05);过表达miR-29a逆转LPS对HPMVECs的损伤作用。萤光素酶报告基因实验证实miR-29a 靶向PTEN,转染miR-29a mimics显著下调PTEN蛋白表达,转染miR-29a inhibitors明显上调PTEN蛋白表达 (P<0.05),但PTEN mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达miR-29a可能通过抑制PTEN蛋白的表达水平、激活Akt/FOXO3a/Bim信号通路对LPS致HUVECs的损伤发挥保护作用。