亚硝酸诱变导致枯草杆菌中L-丙氨酸脱氢酶对L-谷氨酸脱氢酶的转换 Ⅱ.L-谷氨酸脱氢酶阳性变种中L-丙氨酸脱氢酶的诱导形成

枯草杆菌B.subtilis IRC-3-N-1,GDH~+变种在营养培养基上生长时能产生ADH。这样合成的ADH是誘导性貭的。誘导物除了酶的底物,L-丙氨酸外,尚有DL-天門冬氨酸,DL-苏氨酸,D-丙氨酸与丙酮酸。将酶进行純化时,GDH与誘导性的ADH始終同时存在于每一步驟中,而且两者的比例不变。誘导性的ADH与野生型细菌的本貭性ADH在电泳移动率上沒有区別。由于ADH誘导形成时,并末观察到变种細胞內GDH的相应減少,同时抑制了ADH的誘导合成,并不引起GDH水平的变化,因之由后者直接轉变成前者的可能性并不存在。所有GDH~+变种,包括自亚硝酸誘发突变或自发突变来源的,都能誘导生成ADH。从以上这些試驗結果,以及以前关于ADH与GDH免疫学試驗的結果,作者們认为枯草杆菌中,由亚硝酸誘发突变而引起ADH轉換成GDH的原因是由于与ADH合成有关的調节基因发生突变的結果。     

亚硝酸诱变导致枯草杆菌中L-丙氨酸脱氢酶对L-谷氨酸脱氢酶的转换 Ⅰ.二个脱氢酶在某些性质上的相似

枯草杆菌野生型菌株(細胞內仅有L-丙氨酸脫氫酶ADH,没有L-谷氨酸脫氫酶GDH),經亚硝酸处理后引起突变。变种菌株沒有ADH,但获得GDH。将野生型細菌中的ADH与变种細胞中的GDH分別純化60倍后,比較它們的性貭,发現这两种脫氫酶在DEAE-纤維素柱层析,与热稳定性方面均无区別,ADH与GDH的动力学常数也非常相似。只有在免疫学反应方面,这两者有較明显的不同。由于这两种脫氫酶的性貭非砄嗨?同时野生型菌株(ADH~+)經亚硝酸誘发成GDH~+变种以及GDH~+变种誘发回变为野生型的頻率都相当高。因此我們认为因突变而使細菌細胞內ADH轉换为GDH可能由于一点变异所引起。     

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)谷氨酸脱氢酶基因(gdhA), 并研究其表达和功能. 发现野生型IRC-3 GDH-菌株和突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因都能互补大肠杆菌谷氨酸缺陷型菌Q100 GDH-的缺陷性状, 但突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因不能互补野生型IRC-3 GDH-菌株的谷氨酸缺陷性状. 经测序发现两者的核苷酸序列完全一致. gdhA基因在野生型IRC-3和突变型IRC-8中都能正常表达, 在野生型IRC-3细胞中未发现有抑制GDH活性的物质存在. 推测由于GDH翻译后调节的差异导致GDH表型的不同. 根据序列分析, 地衣芽孢杆菌GDH属于六聚体GDH中的家族Ⅰ, 而枯草芽孢杆菌GDH则属于家族Ⅱ, 两者间亲缘关系相距甚远.     

亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸北大核心CSCD

【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成

旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响。成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95%。该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10%以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用。大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础。     

紫云英根瘤菌107菌株酸性胞外多糖的分离纯化及结构分析

用化学沉淀法和柱层析法,分高纯化了紫云英根瘤菌野生型107菌株、胞外多糖合成缺陷型变种NA02及其回复子NA02（R'－11）产生的酸性胞外多糖（EPS）。结构组成分析表明：菌株107与NA02（R＇－11）产生的EPS糖组分均由葡萄糖、半乳糖、核糖和葡萄糖醛酸构成;而变种NA02产生的EPS只含葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸,与野生型显著不同。3个菌株的EPS均有乙酰基取代,而无其它形式的取代基。EPS的酸性来自葡萄糖醛酸。1H－NMR分析表明,野生型菌株107和回复子NA02（R＇－11）的EPS糖残基通过α和β糖苷键方式连接,而变种NA02EPS的糖链中均为α连接方式。     

HBV X基因在大肠杆菌中高效表达及血清抗X抗体检测

本文分别用大肠杆菌(E．Coli的Lpp启动子和M13噬菌体的geneⅡ启动子表达了分子量约为17 kDa的HBx蛋白,并以抗合成x多肽抗血清和抗x融合蛋白抗血清对该重组蛋白进行了分析鉴定(用ELISA法和Western印迹法),然后用重组x蛋白检测肝病病人血清中抗x抗体。我们采用一种改进的ELISA方法检测了212份血清标本,结果表明：肝硬化、慢活肝、肝癌、慢迁肝和急性乙型肝炎病人血清中抗x抗体阳性率分别为49．3％,47．6％、37．8％,29．6％和40．0％,高滴度的抗体主要存在于肝硬化和慢活肝病人血清中。     

HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定

预测Vpr蛋白的B细胞抗原表位,并利用合成的B细胞表位肽制备Vpr特异性抗体。应用生物信息学技术获得Vpr蛋白共享氨基酸序列并预测其潜在B细胞抗原表位,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联合成多肽并免疫家兔,鉴定及纯化获得的多肽特异性抗体。软件预测显示,Vpr蛋白N端的第3～19位(N)和C端的第82～95位(C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价都达到1:105以上;Western-Blotting结果显示,无论对HIV-1B亚型还是CRF07_BC重组型的Vpr蛋白,其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别;免疫沉淀结果显示,Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP-Vpr融合蛋白。利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位,免疫所获得的抗体具有较好的特异性和应用性。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

免疫诊断细胞方法(续一)

<正> 二,抗人的T和B淋巴细胞与其它白细胞抗血清的获得 各淋巴细胞群体和其他型白细胞特异性抗血清,首先必须与相应的细胞起反应。此外,这些抗血清应当除去非特异的抗淋巴细胞作用,从而加强其免疫抑制的特异性。用相应的材料通过免疫动物获得抗血清。因输血姙娠和某些疾病出现的抗淋巴细胞抗体也能用作试剂。 (一)抗T淋巴细胞血清(ATC) 的制备 1.免疫动物的材料。 可用胸腺细胞或无细胞的胸腺组织。作     

腮腺炎病毒抗血清的制备

以制备适用于疫苗生产检定中病毒鉴别试验和外源因子检查的高效价腮腺炎病毒抗血清为目的。用腮腺炎病毒接种SPF鸡胚尿囊腔,培养收取病毒尿液免疫SPF鸡,采集抗血清。腮腺炎病毒接种Vero细胞,培养病毒抗原经PEG沉淀,超速离心法纯化后免疫家兔采集抗血清。比较两种免疫方法所得病毒抗血清效价。结果显示SPF鸡抗腮腺炎病毒血清中和抗体GMT为1:1716,兔抗腮腺炎病毒血清中和抗体GMT为1:732。两种动物抗血清均适用于疫苗生产相关检定。免疫SPF鸡制备的病毒抗血清无特定病原及抗体污染,是毒种外源因子检测和疫苗鉴别试验的理想试剂。免疫SPF鸡制备病毒抗血清的程序简单,结果易于验证,有利于生物试剂标准化。     

人copine Ⅴ蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备兔抗人copine Ⅴ多克隆抗体.方法:将copineⅤ N端423 bp(626～1 048 bp)构建到原核表达载体pET28a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家兔3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用(NH4)2SO4沉淀法初步纯化抗体.结果:表达并纯化了copine Ⅴ N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copine Ⅴ.结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗人copine Ⅴ多克隆抗体.     

重组猪卵透明带-3α抗原及其抗体的制备

目的:制备重组猪卵透明带-3α(rpZP3α)抗原及其抗体供发展避孕疫苗研究。方法:在2L发酵罐中接种毕赤酵母GS115-pZP3α工程菌,高密度发酵表达rpZP3α蛋白,表达的蛋白经螯合镍离子的亲和柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析。rpZP3α免疫家兔,间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。IVF试验体外检测抗rpZP3α抗体对猪、小鼠精卵结合的影响作用。结果:工程菌高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,平均产量为8mg/L,用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,间接免疫荧光法分析显示此抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。体外精卵结合试验中,随着兔抗rpZP3α抗血清浓度的加大,其对猪、鼠精卵结合的抑制作用也增强。ELISA结果显示抗rpZP3α抗体与rpZP3α蛋白以及天然pZP3蛋白两种抗原反应的强度和趋势基本一致。结论:通过酵母体系制备的rpZP3α及其抗体具有免疫学活性。     

PBP2a多克隆抗体制备及其乳胶凝集检测法的建立

目的制备兔抗青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)抗体,建立检测PBP2a的乳胶凝集法。方法以重组PBP2a转肽酶区蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测所制备的抗血清效价和特异性,用纯化的多抗建立乳胶凝集法。结果纯化的重组蛋白免疫家兔能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达1∶25 600,Western blot显示该抗体能有效识别原核表达及MRSA临床分离株中的PBP2a,建立了乳胶凝集法,敏感性及特异性良好。结论成功制备了抗PBP2a抗体血清,初步建立了检测PBP2a的乳胶凝集法,为有效制备高特异的单克隆抗体进而研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。     

p16基因的原核表达及抗P16抗血清的制备

采用基因重租技术,将野生型p16 cDNA通过中间载体pVL1392最后载入表达载体pGEX-5T,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌,蛋白质印迹证实42×10~3的融合蛋白GST-P16的表达。表达了GST-P16的重组菌经加热破菌后行SDS-PAGE,将GST-P16蛋白条带切下后经反复冻融于皮内多点注射免疫家兔。所收获的兔血清经蛋白质印迹法检测到抗P16抗体滴度为1:625。结果表明通过pGEX-5T融合蛋白表达系统能方便地提供制备抗P16抗血清的免疫原,该免疫原未经纯化并未影响抗P16抗血清的产生。     

兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗鱼类免疫球蛋白抗体并进行辣根过氧化酶标记,为鱼类血清学检测系统的建立提供工具。方法利用proteinA亲和层析的方法纯化鱼血清免疫球蛋白,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鱼免疫球蛋白的抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鱼免疫球蛋白的抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting来考察标记抗体与其他常见鱼类血清蛋白间的交叉反应。结果纯化了鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗这五种鱼免疫球蛋白的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼类免疫球蛋白的抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶10000左右,Western blots显示标记抗体与部分其他鱼类免疫球蛋白之间存在不同程度的交叉反应。结论成功制备了HRP标记的兔抗鱼类免疫球蛋白抗体,为鱼类血清学检测体系的建立提供了工具。     

细胞培养狂犬病毒悬液的制备

<正> 狂犬病毒属于弹状病毒科,狂犬固定毒是一个实验室毒株,其特点是致病性低,能在幼地鼠肾细胞(BHK-21C13)中迅速繁殖,该细胞主要用于狂犬病毒复制研究和生产兽用疫苗。 对于严重暴露的病人,在疫苗自动免疫力产生之前,在伤口周围注射抗血清作局部被动抗体使用,可以收到良好的效果。但是,由于过多的被动抗体会抑制自动抗体的产生,因此必须调整好疫苗与抗血清的关系。 抗狂犬病血清传统的生产方法,是用狂犬固定毒注入兔脑内,待发病取脑制备悬液,再用于超免马生产抗血清。这种抗血清     

基因免疫和蛋白免疫制备抗P16抗血清

蛋白免疫,是传统的抗体制备法,基因免疫是新型的抗体制备法。为了制备抗这Ｐ１６抗血甭以及比较基因免疫和蛋白免疫制备抗体,分别以融合谷胱甘肽２－转移酶－Ｐ１６５和克隆有ｐ１６肿瘤抑制基因相关ｃＤＮＡ的裸露真核表达载体ｐＣＭＶ－ｐ１６经皮内多点注射接种家兔,制备抗Ｐ１６抗血清,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测到蛋白免疫的抗Ｐ１６抗血清滴度为１：６２５,明显高于基因免疫制备的Ｐ１６抗血清滴度。     

兔抗金黄地鼠酶标抗体的制备及应用

目的 纯化金黄地鼠血清IgG,制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(IgG-HRP),开展金黄地鼠仙台病毒的初步检测.方法 采用亲和层析纯化法纯化金黄地鼠IgG,用SDS- PAGE电泳测定IgG纯度并制备兔抗金黄地鼠IgG抗体(second antibody,Ab2);用免疫双扩散法检测抗血清效价后,再用亲和层析纯化抗血清IgG( Ab2);采用改良过碘酸钠标记法制备兔抗金黄地鼠酶标抗体( rabbit anti-hamster IgG-HRP);用直接ELISA和Western-blot法对兔抗金黄地鼠IgG酶标抗体进行工作浓度测定;应用金黄地鼠酶标抗体对金黄地鼠仙台病毒进行酶免检测(IEA).结果 金黄地鼠血清IgG纯度达95％;兔抗金黄地鼠IgG抗体(Ab2)免疫双扩散效价为1(:)64;兔抗金黄地鼠IgG -HRP经直接ELISA和Western-Blot测定工作浓度分别为1∶5000和1∶2000;酶免(IEA)效价为1:2000.结论 高效快速纯化了金黄地鼠IgG,制备了金黄地鼠IgG-HRP,为金黄地鼠病原微生物的血清学检测提供了条件.