固定化原生质体产谷氨酸脱氢酶的研究

本文报道了用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化谷氨酸捧杆菌T6—13原生质体及其用于生产谷氨酸脱氢酶(GDH,E．C．1．4．1．4)的研究。在一定条件下游离细胞和固定化细胞胞内可积累谷氨酸脱氢酶,但并不分泌到胞外。对数生长前期的细胞经蛋清溶菌酶处理14h后分离得到原生质体,游离原生质体和固定化原生质体可产胞外GDH。用3％海藻酸钙凝胶包埋10%的原生质体制备的固定化原生质体具有较高的产酶性,分批培养72h后发酵液中GDH活力可达到1．64×10^-2u／ml,为游离细胞胞内产酶的205％。固定化原生质体可用溶菌酶处理固定化细胞而制得,与直接固定化原生质体制备的固定化原生质体具有同样的产酶能力,且制备方便。固定化原生质体可重复使用6批次(约18天),且具有良好的贮藏稳定性。     

谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶 (GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶 ,谷氨酸棒杆菌S91 1 4是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种 ,其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶 ,研究其辅酶组成 ,对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质 ,提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、ED TA的Tris_HCl缓冲液 (pH 7 5 )洗涤 ,用Frenchpressurecellpress破碎 ,离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用 KTA_10 0快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱 (HIC)、G_2 0 0凝胶过滤柱层析得到纯化大约 70倍的以NAD PH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一 ,不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为 188kD和 32kD ,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHIU_30 0 0分光光度计利用NAD(P)H在 340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford方法进行 ,并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S91 1 4中确实存在两种GDH ,其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样 ,S91 1 4可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢 ,以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。     

谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶(GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶,谷氨酸棒杆菌S9114是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种,其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶,研究其辅酶组成,对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质,提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、EDTA的Tris-HCl缓冲液 (pH 7.5)洗涤,用French pressure cell press 破碎,离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用?KTA_100快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱(HIC)、G-200凝胶过滤柱层析得到纯化大约70倍的以NADPH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一,不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为188kD和32kD,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHI U-3000 分光光度计利用NAD(P)H在340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford 方法进行,并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S9114中确实存在两种GDH,其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样,S9114可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢,以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。同时发现以NADPH为辅酶的GDH在280nm吸收很弱,在215nm吸收很强。说明此酶中酪氨酸、苯丙氨酸含量较低。     

NaCl对水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的胁迫作用

在ＮａＣｌ的胁迫下,水稻幼苗根和叶的谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的活性随着营养液中的ＮａＣｌ浓度的升高而降低;游离ＮＨ４＾＋在叶中积累,在根中未见明显变化。与根相比,叶对ＮａＣｌ的胁迫作用更为敏感。叶的ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ和ＮＡＤＨ－ＧＤＨ活性在ＮａＣｌ胁迫降低的程度明显大于根。无论是否有ＮａＣｌ存在,根的ＮＡＤＨ－ＧＤＨ活性明显高于叶。ＧＳ／ＧＤＨ比值分析提示,对对照下,根中的ＮＨ４＾存在,根的ＮＡ     

猪肝过氧化氢酶提取条件的研究

采用水浸提法提取猪肝过氧化氢酶。选择浸提时间、温度、料水比作为单因素进行梯度实验,确定其条件范围,再通过进一步的正交实验得到猪肝过氧化氢酶提取条件的优化组合,即料水质量比1：5,浸提温度25℃,浸提时间8h。     

猪肝过氧化氢酶提取条件的研究

过氧化氢酶又称触酶,专一分解过氧化氢,溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚。传统方法是从牛、马或人的红细胞、肝、肾中通过选择性沉淀法、缓冲液提取法、层析法等提取过氧化氢酶。本研究以猪肝为原料对过氧化氢酶的提取条件进行了试验。根据猪肝过氧化氢酶在pH5．3—8．0有活性、最适pH为7．0、溶于水的特性,采用水浸提法提取猪肝过氧化氢酶。先选择影响提取的主要因素(浸提时间、温度、料水比)分别作为单因素进行梯度实验,确定其合适范围;再通过进一步的正交实验得到猪肝过氧化氢酶提取条件的优化组合,并综合后处理中固液分离的要求,确定最佳提取条件,即料水比15、浸提温度25℃、浸提时间8h。     

Amphibacillus xylanus谷氨酸脱氢酶基因工程菌培养条件优化

首先构建了5株表达NADH依赖型谷氨酸脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌,获得来源于Amphibacillus xylanus的谷氨酸脱氢酶AxyGDH。其最适温度为60℃、最适p H为8.0,该条件下比酶活达到(903.1±24.6)U/mg,酶活半衰期为167h。其次,确定了表达AxyGDH的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AxyGDH的产酶条件:诱导剂IPTG浓度为0.7mmol/L、诱导温度为25℃;优化后的培养基组成为:甘油11.3g/L,酵母粉16.3g/L,Mg SO_4·7H_2O 0.62g/L,NaCl 0.5g/L,Na_2HPO_4·12H_2O 17.1g/L,KH_2PO_43g/L,NH_4Cl 1.5g/L。最后,在10L发酵罐中控制比生长速率为0.2h~(-1)进行补料分批发酵,所得AxyGDH的发酵酶活为(9 066±45)U/ml,是LB摇瓶发酵酶活的51.1倍,为谷氨酸脱氢酶的低成本生产奠定了基础。     

酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶的诱导、提纯和性质

在YEPD培养基中添加NaCl,可以诱导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞内3-磷酸甘油脱氢酶的形成,当NaCl浓度达5％时,酶比活从0.05U/mg提高0.5U/mg;若再限制培养墓中葡萄糖浓度在100mg/L以下,酶比活可达到0.89U/mg。酶比活与培养基中的NaCl浓度的函数关系式为:Sa=0.129C~3-0.038C~2+0.034C+0.063(0≤C≤5％)。粗酶液经Sephadex G-25凝胶过滤,Blue Sepharose亲和层析以及Mono Q离子交换等步骤,提纯123.6倍,得纯酶液。经SDS-凝胶电泳测得分子量为45000±2000。酶的最适温度为51℃,最适pH值为6.8。保温30分钟的半失活温度(t_(1/2))为41℃。NADH和DHAP的Km(mmol/L)值分别为:0.017和0.134。     

谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与谷氨酸合成

为阐明谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与菌体的生长以及谷氨酸合成之间的关系 ,以谷氨酸棒杆菌基因组测序用典型菌株Corynebacteriumglutamicum ATCC 130 32为出发菌株 ,构建了乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株Corynebacteriumglutamicum WTΔA。该菌株没有异柠檬酸裂解酶活性 ,不能在以乙酸盐为唯一碳源的基本培养基上生长。与出发菌株ATCC13032相比 ,WTΔA在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时不受影响 ,说明谷氨酸棒杆菌并不需要乙醛酸循环途径提供菌体生长所需的能量和生物合成反应所需的中间产物。但是 ,与出发菌株ATCC13032相比 ,WTΔA的谷氨酸合成能力大幅下降。     

天津短杆菌T6-13谷氨酸脱氢酶的研究

本文研究了天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)T6-13谷氨酸脱氢酶(GDH)[EC1.4．1．4]的纯化和性质。该酶以辅酶11(NADP)为其专一性辅酶,正、逆反应酶活力最适pH分别为7．5和8．9—9 9,对热较敏感。 该酶对还原型辅酶11(NADPH)、α-酮戊二酸(α-KG)、NH,、NADP和L-谷氨酸(GA)的Km值分别为0．076、3．23、4．0、0．02和120．48 mmol／L。该酶受反应产物的抑制,逆反应受NADPH、α-KG和NH+4的抑制,正反应受NADP和谷氨酸的抑制,但该酶所催化的逆反应既不受三羧酸循环代谢中间产物的抑制,也不受氨基酸的抑制和氨基酸的积累抑制。对发酵过程中谷氨酸脱氢酶活力变化的研究表明,前期酶活力逐渐上升,当发酵至16小时左右酶活力最高,其后酶活力逐渐下降;二级种子的酶活力与发酵过程中酶活力最高时相当。     

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)谷氨酸脱氢酶基因(gdhA), 并研究其表达和功能. 发现野生型IRC-3 GDH-菌株和突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因都能互补大肠杆菌谷氨酸缺陷型菌Q100 GDH-的缺陷性状, 但突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因不能互补野生型IRC-3 GDH-菌株的谷氨酸缺陷性状. 经测序发现两者的核苷酸序列完全一致. gdhA基因在野生型IRC-3和突变型IRC-8中都能正常表达, 在野生型IRC-3细胞中未发现有抑制GDH活性的物质存在. 推测由于GDH翻译后调节的差异导致GDH表型的不同. 根据序列分析, 地衣芽孢杆菌GDH属于六聚体GDH中的家族Ⅰ, 而枯草芽孢杆菌GDH则属于家族Ⅱ, 两者间亲缘关系相距甚远.     

牛肝L-谷氨酸脱氢酶在压力下的解离

运用荧光光谱方法研究了牛肝Ｌ－谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）在压力下的解离。研究表明,在２ｋｂａｒ时ＧＤＨ由六聚体解离成亚基,标准解离体积变化为－２９３ｍｌ／ｍｏｌ,解离自由能为４８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（１０℃）。ＧＤＨ在压力下的解离还显示出异常的浓度依赖性,表明在天然寡聚蛋白的布居中存在着自由能不同的单体聚合。不同温度下的ＧＤＨ解离研究结果表明,由亚基－六聚体的聚合是一熵增驱动过程。ｂｉｓ－ＡＮＳ存在时观察到的现象,暗示谷氨酸脱氢酶的亚基解离过程中发生了构象漂移（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｄｒｉｆｔ）。此外还研究了底物结合对解离的影响     

谷氨酸氧化酶电极的研究

用戊二醛作交联剂将谷氨酸氧化酶和牛血清白蛋白共交联,置于内层醋酸纤维素抗干扰膜和外层聚碳酸酯扩散控制膜之间,制成酶膜,将其与过氧化氢探头复合制成了扩散控制型谷氨酸氧化酶电极,并构建了采用该电极的流动注射分析芽纺。酶电极红性范围0—1000mg／L。50s响应电流达稳态值的95％。流动注射分析系统响应时间20s,检测速度60次／h,线性范围5—8 000mg,L,酶膜使用寿命两周以上。系统选择性好,仅对干扰物L－谷氨酰胺和L－天冬氨酸有微弱响应。对同一样品连续测定41次的变异系数2．8％。测量味精发酵液和瓦勃呼吸计的结果相吻合。可望应用于味精发酵及食品工业中。     

固定化谷氨酸氧化酶管流动注射测定谷氨酸的研究

多孔玻璃珠固定谷氪酸氧化酶与过氧化氢酶分别制成相应的固定化酶管,结合流动注射分析系统测定谷氨酸的含量。测定线性范围在0．1—2．O mmol／L．精度(c．V)O．7％．测定速率每小时80样以上．使用寿命至少4个月。在各氨酸浓度低于2．5mmol／L时．pH在6．5—8．0．温度20—35℃．磷酸盐浓度在0.05—0.25mol／L范围内对测定几乎无影响．对不同发酵时间的谷氨酸发酵液测定,测定的结果与酶试剂盒及瓦氏法比较,结果一致．说明该方法已具有实际应用价值。     

高等植物中的谷氨酸脱氢酶及其生理作用

谷氨酸脱氢酶普遍存在于植物体内,它虽然不是植物吸收利用氮的主要成员,但在植物氮代谢中起着重要作用,高等植物的谷氨酶主要存在于线粒体中,以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）为辅酶,该酶分子量为255－258kD,由六个亚基组成,亚基包括α和β两种类型,存在七种同工酶形式,它在植物的衰老过程及逆境如高温和水份胁迫等状况下行使其铵同化功能,但在黑暗或碳胁迫条件下又能氧化脱铵从而为三羧酸循环提供骨架。     

菜心溶菌酶的提纯及酶学性质

菜心叶子高速捣碎后,滤液经酸碱处理,硫酸铵分步沉淀,凝胶柱层析等步聚分离纯化溶菌酶,酶比活力达３４１４．６Ｕ／ｍｇ,纯化倍数为１９７．４。菜心溶菌酶在较宽的温度或ｐＨ值范围均有活性,最适温度６０℃,最适ｐＨ值为５．８,底物Ｋｍ值为８７μｇ／ｍＬ。该酶对热和酸碱的稳定性较高,巯基和酪氨酸残基不是该酶活性中心的必需基团。