青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

青Jiang p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long-PCR”技术,用6对p53引物从青Jiang胚胎干细胞基因组DNA中扩增出6个相互重叠的片段,其中最大的片段长达4.5kb,这6个PCR片段覆盖了整个p53基因。序列分析表明青Jiang p53基因长约8.7kb,由11个外显子和10个内含子组成。结构比较表明,青Jiang p53基因在大小上与人和小鼠p53基因存在较大差异。青Jiang p53基因的内含子1仅为0.85kb,而人和小鼠p53基因的内含子1则分别长达10kb和6kb;青Jiang p53基因的外显子3（86bp)明显大于人和小鼠p53基因的外显子3（22bp);外显子4（170bp)比人（280bp)和小鼠（260bp)的外显子4小;内含子10（3.5kb)则比人和小鼠内含子10（0.7kb和0.9kb)大得多。用SVTK－neo基因作正选择标记基因,用SVTK－tk基因作负选择标记基因,用青Jiang p53基因组片段作同源序列,构建了鱼类p53基因同源重组载体。将此载体转染青Jiang胚胎干细胞,并经G418和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达,并提供对G418的抗性和对Ganc的敏感性。     

热带爪蟾Hoxa11基因克隆及序列的进化分析

 H oxa1 1基因是控制脊椎动物肢发育的重要基因 .根据人和鼠 H oxa1 1基因外显子 区和 区的保守序列设计了简并引物 ,采用 PCR法从热带爪蟾基因组 DNA中扩增和克隆到了H oxa1 1基因 ,并测定了核苷酸序列 .克隆的热带爪蟾 H oxa1 1基因片段长 1 598bp,由外显子 、内含子和外显子 三部分组成 ,其中外显子 60 4 bp,外显子 49bp.将该片段的核苷酸序列与人、鼠、斑马鱼 H oxa1 1基因的相应区域进行比较 ,发现该基因的内含子长度存在明显差异 .斑马鱼、热带爪蟾、鼠和人的内含子长度分别为 632 bp,945bp,1 42 1 bp和 1 41 2 bp,随动物进化阶梯的提高而变长 .外显子 区则高度保守 ,都是 49bp,外显子 区在长度上呈现约 1 0 %的变异 .将热带爪蟾 H oxa1 1基因编码的氨基酸序列与人、鼠、斑马鱼进行比较 ,它们之间分别有 67.0 %、66.5%和 46.0 %的同源性 .热带爪蟾与哺乳动物的同源性高于鱼类 ,可能反映了脊椎动物从鳍到肢的进化过程中 ,H oxa1 1基因经历了较多的变异 .     

棉花GhZIP4基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR和PCR方法,从陆地棉‘苏棉18’-cDNA和基因组DNA中分别克隆获得了GhZIP4基因片段.结果表明:(1)GhZIP4基因cDNA序列全长1 487 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸残基,其氨基酸序列具有典型的ZIP蛋白特征,预测具有8个跨膜结构域,第Ⅲ和第Ⅳ跨膜结构域间存在可变区,在可变区有2个富含His的结构域“HRHSHPHG”和“HSHGHGHD”.(2)氨基酸进化树分析显示,GhZIP4同拟南芥ZIP家族AtZIP4的相似性较高.(3)GhZIP4 DNA序列编码区全长1 778 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.(4)半定量分析显示,GhZIP4基因在茎中表达量最高,表明该基因有可能在某些金属离子地上部和根部的动态平衡分布过程中具有重要作用.     

全雌性黄瓜中3个肌动蛋白基因片段的克隆和表达分析

通过1次PCR扩增从全雌性黄瓜中同时获得了长度分别为1 186bp、955 bp和870bp的3个肌动蛋白基因片段Act1、Act2和Act3(GenBank登记号:DQ115881,DQ115882和DQ115883).序列分析表明,3个肌动蛋白基因片段与GenBank中收录的肌动蛋白基因序列高度同源,与GenBank中收录的全长肌动蛋白基因(如AF386514.1、AF059484.1和AB010922.1等)的第2、第3个外显子和第2个内含子相对应.Act1中1-580 bp、984～1 186 bp,Act2中1-580 bp、753-955bp,Act3中1-580 bp、668-870 bp为外显子编码区,其余为内合子序列,3个基因内含子的两端序列均符合典型的"GT-AG"规则.RT-PCR分析表日月,Act1仅在根中表达,Act2在根和雌花中表达,而Act3在所有检测的器官(包括根、茎、叶、卷须,雌花和幼果)中都表达,提示黄瓜根的生长发育需要多种肌动蛋白基因的参与,而Act2和Act3可能与黄瓜雌性系的形成发育有关.     

牦牛HSFY基因的克隆及其结构分析

Y染色体上的热休克转录因子(HSFY)是精子发生障碍的候选基因之一。通过克隆牦牛HSFY基因,并与普通牛Y染色体上的84条HSFY序列比对。结果表明:牦牛HSFY基因由2个外显子和1个内含子组成,与普通牛基因组中的相应序列的一致性高达99.54%。牦牛、普通牛的该基因具有4处插入/缺失,且序列与其相邻序列极为相似。在1 012-1 020 bp(Ⅰ)处有AAAGAAGA/TG等9个核苷酸缺失,位于内含子内;在1 071-1 073 bp(Ⅱ)、1 249-1 251 bp(Ⅲ)处分别有AAG、CCA/C等3个核苷酸缺失,位于第二外显子内,分别导致赖氨酸和组氨酸的缺失;在1 708-1 710 bp(Ⅳ)处有CAA 3个核苷酸缺失,位于3’末端非编码区。在普通牛的84条HSFY基因序列中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ插入/缺失分别有29、3、2、1次。未发现Ⅱ、Ⅲ同时缺失的拷贝,但Ⅱ、Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失,且导致了蛋白三维结构的变化。牦牛HSFY是在睾丸中表达的多拷贝基因,经密码子偏好性分析,该基因编码的蛋白质偏好使用以A或T结尾的密码子。     

异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白 B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4 kb和2.1 kb的片段.测序及比对分析表明：这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT/AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明：无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1 025 bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明：对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.     

大黄鱼白细胞介素8基因克隆及特征分析

白细胞介素8是一种CXC型趋化性细胞因子,在免疫反应中起着非常重要的作用。本文在构建大黄鱼肌肉组织cD-NA文库的基础上,克隆了白细胞介素8基因。克隆到的白细胞介素8全长为2582bp,基因组包含106bp的5’端非编码区,52bp的外显子Ⅰ,168bp的内含子Ⅰ,133bp的外显子Ⅱ,149bp的内含子Ⅱ,87bp的外显子Ⅲ,682bp的内含子Ⅲ,13bp的外显子Ⅳ和1192bp的3’端非编码区,编码序列285bp,编码94个氨基酸。氨基酸序列具有趋化性因子CXC家族的结构特征,在进化上高度保守,与鲈鱼的同源性在90％以上。在检测的大黄鱼的10种组织中,表达量较高的为肾、肝、肠和脾,脑、心和肌肉中表达量较低。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC1 62 66总DNA中扩增出大小为 1 374bp和 1 947bp的两条特异片段 ,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为 5 73bp的内含子和两条分别为 1 97bp和 82 8bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明 ,该基因有两个长的跨膜疏水区和 3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物 ,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交 ,证明在其基因组中确实存在两个Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL6 1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2 0中 ,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析 ,检测到了γ 亚麻酸 ,说明克隆的D6D基因MAGL6 1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

3种鲤科鱼β珠蛋白基因的比较研究

根据 β珠蛋白的N末端和C末端氨基酸序列的保守性设计 2 0bp长的简并引物 ,用RT PCR方法扩增并克隆了鲤、草鱼、鲫的 β珠蛋白基因cDNA。结果显示克隆 3种鱼的 β珠蛋白基因cDNA全长为 4 4 1bp。对它们所编码的氨基酸序列的比较可以看出虽然它们都属于鲤科但氨基酸的组成却有较大的差异。根据所克隆的cDNA分别设计特异引物用PCR方法克隆了 3种鱼的基因组DNA全长 ;从起始密码子到终止密码子的长度分别为鲤 6 6 7bp、草鱼6 2 9bp、鲫 6 6 7bp。 3种鱼中均含有 3个外显子和 2个内含子且内含子的插入位置相同。内含子的碱基序列差异很大。鲫与鲤内含子 1和 2的长度完全相同 ,而与草鱼的内含子长度则相差较大。     

矛尾鱼Hoxa—11基因克隆及5′端序列分析

Hoxa-11基因调节鱼类鳍和四足动物肢的发育,在脊椎动物进化过程中起着重要的作用,利用人和鼠的Hoxa-11基因保守序列设计了两个兼并引物,通过PCR扩增到了矛尾鱼的Hoxa-11基因,经克隆和DNA序列分析,该片段为2065bp,包括绝大部分外显子Ⅰ,内含子和部分外显子Ⅱ,编码204个氨基酸,其氨基酸序列与人、鼠、鸡、蛙和斑马鱼的同源性分别为66.0%、67.6%、74.4%、72.8%和59.7%。外显子Ⅰ的长度从矛尾鱼到蛙、鸡、鼠和人呈现逐步上升趋势,人比矛尾鱼增长了16%,进一步分析,外显子Ⅰ可分为4个区域;两个高度保守区域,1个中度保守区域和1个可变区域,外显子Ⅰ的长度变化主要是由于可变区域内丙氨酸同聚物以及两侧富含甘氨酸和丝氨酸序列的累积。矛尾鱼只有1个由两个丙氨酸组成的同类物,蛙有1个由5个连续丙氨酸组成的同聚物,而鸡、鼠和人有3个丙氨酸同聚物,其中最大的同聚物由7个连续丙氨酸组成,而且在同聚物两侧出现了富含甘氨酸和丝氨酸序列。这表明可变区域可能与脊椎动物进化和鳍-肢转换过程中新功能的获得有关。同源异型盒所在的外显子Ⅱ区和剪接位点是高度保守的。内含子的长度变化较大,但在其内部也发现了两个高度保守的35bp和16bp的DNA片段,这两个片段在人、鼠、鸡、蛙和矛尾鱼中是完全相同的,这些序列的高度保守性提示其功能上的重要性。     

葫芦藓LEAFY基因和启动子的克隆及表达分析

本研究以孢子植葫芦藓为试验材料,采用Tail-PCR与RT-PCR相结合的方法克隆得到葫芦藓LFY基因(FhLFY)的完整片段,该基因DNA全长为2 527bp,包含4个外显子和3个内含子序列,有1个1 050 bp的完整开放阅读框,编码349个氨基酸.通过Tail-PCR技术克隆得到905 bp的FhLFY基因启动子...     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC16266总DNA中扩增出大小为1374bp和1947bp的两条特异片段,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为573bp的内含子和两条分别为197bp和828bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明,该基因有两个长的跨膜疏水区和3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交,证明在其基因组中确实存在两个Δ6脂肪酸脱氢酶基因,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL61克隆到的酿酒酵母表达载体pYES20中,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析,检测到了γ亚麻酸,说明克隆的D6D基因MAGL61能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)基因组DNA的分子克隆和序列分析

运用反向PCR (IPCR)技术首次克隆得到全长为 3 50 6bp的中华绒螯蟹 (Eriocheirjaponicasinensis)蜕皮抑制激素 1(MIH 1)基因组DNA序列 (GenBank检索号 :AY3 10 3 13 )。该序列包括 3个外显子、 2个内含子、 412bp的 5′端上游调控区和 917bp的 3′端UTR。编码区的第 1个内含子将信号肽分开 ,第 2个内含子将成熟肽分开。MIH 1基因的外显子和内含子接头区符合受体拼接点和供体拼接点的GT AG法则。MIH 1基因412bp的 5′端侧翼区含有和其它真核基因相似的启动子元件 ,即包括与其它节肢动物高度相似的起始子、TATA盒以及cAMP效应元件结合蛋白的结合位点序列。中华绒螯蟹MIH 1基因的组织方式与斑纹和食用黄道蟹的MIH基因相同。推导的多肽由 75个氨基酸的成熟肽和 3 5个氨基酸的信号肽组成 ,成熟肽的氨基酸序列和食用黄道蟹、三叶真蟹及美洲黄道蟹的一致性在 64% -65%之间     

油莎豆PEPCase基因ppc的克隆及初步分析

[目的]油莎豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的分子克隆及初步分析。[方法]通过对Gen Bank中其他植物PEPCase基因进行同源性比对,设计简并性引物,用PCR法克隆获得PEPCase编码基因ppc的两个片段S1和S2。[结果]S1、S2片段长度分别为577 bp和190 bp,生物信息学分析表明,S1片段全部位于ppc基因第8外显子区域,S2片段包含ppc基因第8外显子3’端序列,第9外显子5’端序列以及它们之间的内含子区域。[结论]S1、S2片段长度分别为577 bp和190 bp。Blast比对结果表明,油莎豆ppc基因S1S2全长片段与Cyperus ustulatus(PEPC-C4-1)、Cyperus longus、Cyperus iria和Cyperus papyrus的同源性均为97%,与Cyperus rotundus同源性为96%。进化树分析结果表明,油莎豆ppc基因S1和S2片段与莎草属Cyperus ustulatus、Cyperus longus、Cyperus iria等的ppc基因的进化亲缘关系最近。     

Dystrophin基因51号外显子缺失连接片段的克隆和测序

为了解Dystrophin基因缺失断裂点和连接片段的序列特点,以分析Dystrophin基因缺失的分子机制,利用巢式反向PCR克隆了1名51号外显子缺失DMD（Duchennne Muscular Dystrophy,DMD）患者的缺失连接片段,通过测序,确定5‘和3‘断裂点及连接片段的序列。对5‘、3‘断裂点和连接片段进行重复序列、TOPOI、TOPOⅡ酶切位点等分析。结果共测得50号内含子1614bp,确定该患者Dystrophin基因的5‘断裂点位于THE1（Transposon-like Human Element,THE）内,3‘断裂点位于L2序列内。连接片段有3bp的连接同源序列cta,局部无小的缺失、插入和碱基置换。本研究首次在50号内含子内发现-THE1序列,再次发现Dystrophin基因的缺失断裂点位于THE1结构内。反向PCR操作简单、耗时短,可以推扩应用于缺失连接片段的克隆;THE1可能与部分Dystrophin基因的缺失有关;Dystrophin基因缺失大多与同源重组无关,非同源末端连接可能参与了Dystrophin基因缺失的形成。     

人乳铁蛋白cDNA 基因乳腺表达载体的构建与鉴定

为了构建人乳铁蛋白基因 (hLF) 的乳腺表达载体并验证其在乳腺细胞中的表达情况,本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5′端调控序列,下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3′部分基因组片段作为3′端调控序列,长度分别为6.2 kb和7.1 kb,将hLF基因 (目的基因) 和Neo基因 (筛选标记) 分别插入到5′端调控序列和3′端调控序列的下游,构建成pBC1-hLF-Neo载体,其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学     

牙鲆MHC-DAA结构及其等位基因多态性

为了探讨牙鲆MHC-DAA等位基因的多态性, 根据牙鲆 (Paralichthys olivaceus) MHC-DAA的cDNA序列设计特异引物, 扩增内含子序列。牙鲆DAA基因由4个外显子和3个内含子组成, 与大西洋鲑 (Salmo salar) DAA基因结构相同, 在内含子2中存在一个高度多态的微卫星位点(GT)n。根据获得的MHC-DAA基因组序列设计特异性引物, 在45尾牙鲆中扩增了包括完整外显子2和内含子2的长度约670 bp的DNA片段, 克隆测序后共发现30个MHC-DAA等位基因, 各等位基因的频次及其各主型中亚型的数目都不均衡。在249 bp的外显子2序列中共有55个位点发生变异, 核苷酸多样性指数为0.0887, 编码的氨基酸序列中多态变异位点31个, 其中简约信息位点30个, 单变异位点1个。非同义替代与同义替代的比率在PBR(Peptide binding region)和非PBR结合区分别为3.30和2.43, 分析证明平衡选择是牙鲆存在众多DAA等位基因的发生机制。     

高山被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC16266总DNA中扩增出大小为1374bp和1947bp的两条特异片段,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为573bp的内含子和两条分别为197bp和828bp的外显子,推导的氨基酸二级结构分析表明,该基因有两个长的跨膜疏水区和3个组氨酸保守区,分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区,Ⅲ区的序列设计引物,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交,证明在其基因组中确实存在两个△^6-脂肪酸脱氢酶基因,其中一个基因含有内含子,把不含有内含子的核基因MAGL6-1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2.0中,转化到酿酒酵母INVSc1中,对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析,检测到了γ-亚麻酸,说明克隆的D6D基因MAGL6-1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。