色氨酸发酵的初步研究

我们从271株酵母菌中,选出一株可利用邻氨基苯甲酸为前体产生色氨酸的优良菌株——阿保利假丝酵母(Candida arborea AS 2．566)。对该菌的发酵条件进行了初步研究,发现通气量、邻氨基苯甲酸浓度等与色氨酸产量有密切关系。采用乙醇一邻氨基苯甲酸混合分次追加的方式,可提高色氨酸的产量。用30升发酵罐试验,色氨酸产量达5克／升以上。     

L—色氨酸产率提高50％

日本味素公司成功地将色氨酸的遗传因子增强到枯草杆菌中,使L—色氨酸产率提高50％。即将菌体内具有生成L—色氨酸的前体物质邻氨基苯甲酸积累转换为L—色氨酸的生物合成基因组入到枯草杆菌K菌株中,这样能使菌体内的邻氨基苯甲酸87％转换为L—色氨酸,使色氨酸产率增加50％,成本大大下降。     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

L-色氨酸的制取(发酵法)

<正> 发明的背景这项发明涉及到通过发酵制取L-色氨酸的方法作为必要的氨基酸之一,L-色氨酸是很有用处的。很需要寻找一种适以大规模生产的、经济实用的生产方法。通常,L-色氨酸在含有一种前体(例如,吲哚,邻氨基苯甲酸或丝氨酸)的培养基上通过发酵而制取。(如日本公开特许71-27353),或者     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因(ASA2)作为筛选标记基因,并采用氨基酸的类似物5—甲基色氨酸为筛选剂,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高59％～123％。PCR检测转化子1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物(烟草)编码的邻氨基苯甲酸α—亚基能够与另一种植物(大豆)编码该酶的β—亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论。     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸 ,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因 (ASA2 )作为筛选标记基因 ,并采用氨基酸的类似物 5-甲基色氨酸为筛选剂 ,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组 ,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高 5 9%～ 12 3%。PCR检测转化子 1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物 (烟草 )编码的邻氨基苯甲酸α 亚基能够与另一种植物 (大豆 )编码该酶的 β 亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论     

脱硫创新霉素对邻氨基苯甲酸合成酶活性的影响

<正> 用两种实验方法观察了脱硫创新霉素对ASase活性的影响。1.药物对E.coli BT36(Trp~- phe~- tyr~-)积累邻氨基苯甲酸的影响。发现脱硫创新霉素虽然部分抑制邻氨基苯甲酸的积累,却不出现分支酸的积累,而色氨酸在抑制邻氨基苯甲酸积累的同时出现分支酸积累。2.药物对ASase的作用。发现税硫创新霉素和创新霉素均不能抑制ASase活性,而色氨酸能显著抑制ASase活性,从而证明了脱硫创新霉素和创新霉素的抗菌作用不是通过反馈抑制色氨酸途径第一酶ASase的活性而实现的。     

发酵液中 L-色氨酸的提取

L-色氨酸为必需氨基酸之一,在人体代谢有着重要的功用,是配制复合结晶氨基酸注射液的基本原料,其价格昂贵,国内尚供不应求。至今,除用化学合成生产色氨酸外,利用微生物发酵法生产 L-色氨酸已越来越受到人们的重视,国内外均有不少研究报告。根据中国科学院微生物研究所的研究报告,我们于1976年采用邻氨基苯甲酸为前体物发酵法,协作进行了 L-色氨酸的试制工作。当时,由于受到强烈地震的影响,试制工作未能园满结束,但在克服重重困难之后,仍然摸索了一     

大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达

目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。     

利用氯霉素副产品物邻硝基乙苯合成L—色氨酸

<正> L—色氨酸是人体必须的八种氨基酸之一,主要用于制造复方氨基酸输液,同时在医疗、食品和饲料等方面的应用也日益广泛,在经济上具有广阔的发展前景。本厂在氯霉素生产的硝化过程中伴有大量邻硝基乙苯生成,长期以来,这些副产品由于得不到合理利用,不仅使大量社会财富白白浪费,且给工厂的环保和安全构成了严重的威胁。因此,利用这些副产物合成社会需求的产品L—色氨酸是一项一举两得、经济效益十分显著的课题。     

北京棒杆菌芳香族氨基酸转运蛋白基因敲除对L-色氨酸积累的影响

[目的]为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响.并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响.[方法]运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体.利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67 ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证.采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒.将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67 ΔaroP/pXAS.通过摇瓶发酵研究PD-67 AaroP和PD-67 ΔaroP/pXAS的发酵特性.[结果]经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株.摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65％.酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67 △aroP中得到表达.AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6％.[结论]北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因arop的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量.在arop基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率.     

组合代谢调控提高大肠杆菌对氨基苯甲酸产量

对氨基苯甲酸是一种重要的有机合成中间体,广泛应用于医药、染料等行业。近年来对氨基苯甲酸作为一种潜在的高强度共聚物单体越来越受到重视。对氨基苯甲酸作为叶酸合成的前体之一,其合成在大肠杆菌体内由叶酸合成途径的pabA、pabB和pabC三个基因负责,催化分支酸合成对氨基苯甲酸。本研究以实验室构建的酪氨酸高产工程菌TYR002作为出发菌株,首先弱化双功能分支酸突变酶/预苯酸脱氢酶TyrA的表达,以减少酪氨酸积累,然后利用3种不同强度的组成型启动子分别调控pabA、pabB和pabC的表达。摇瓶发酵表明不同的组合调控模式下大肠杆菌发酵培养基中的对氨基苯甲酸积累量存在显著差异,最高可获得0.67 g/L的摇瓶发酵产量。进一步通过发酵条件优化和分批补料发酵,在5L发酵罐中获得了6.4g/L的对氨基苯甲酸产量。本研究为改善对氨基苯甲酸生物合成效率提供了重要理论参考。     

豆豉纤溶酶产生菌分离和鉴定

从全国各地收集豆豉样品,采用不同的培养基进行富集培养,并利用纤维蛋白平板法高效获得了13株形态差异较大的产纤溶酶菌株。通过传统方法、化学方法以及16S rRNA序列分析对这13株菌进行分类鉴定,它们分属于芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属以及节杆菌属,包括9种细菌,丰富了豆豉纤溶酶产生菌菌种资源。     

头状轮生链霉菌芳香族氨基酸合成途径的调节

对头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)芳香氨基酸合成途径的研究表明,第一个酶即3—脱氧—α—阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶无同工酶,不被L-色氨酸阻遏,比活力可被硝酸盐促进。L-色氨酸强烈地反馈抑制此酶,L-酪氨酸和L-苯丙氨酸无作用。L-色氨酸的反馈抑制对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是非竞争性的,K_I为373μmol/L。酶对PEP和4-磷酸亦藓糖(E4P)的K_m值分别为50和100μmol/L。PEP和C0²⁺对酶有稳定作用。邻氨基苯甲酸合成酶活力可被1mmol/L L-色氨酸完全抑制,此酶也受L-色氨酸的阻遏,但是色氨酸支路上其余4个酶不被阻遏。分支酸变位酶被L-酪氨酸抑制。L-苯丙氨酸抑制预苯酸脱水酶,并更强地抑制预苯酸脱氢酶。     

海水中组胺菌的分离及其理化性质分析

目的:对海水中的组胺牛成菌进行生化实验和功能酶检测,进而对海水中组胺菌的存在提供可参考数据.方法:利用组氨酸肉汤培养液,对海水中的组胺生成菌进行筛选.然后通过生物化学实验和形态学实验,进而对组胺生成菌进行分析.结果:分离得到2株细菌.结论:依据两种组胺菌的特征和生理生化特征,分离菌可能分别属于奈瑟氏菌属、黄杆菌属.     

阿尔山不同时期落叶松根际土壤固氮菌的多样性研究

利用传统的细菌分离培养,结合16S rDNA序列分析等方法,对阿尔山地区不同时期落叶松根际可培养固氮菌群落的多样性进行分析,以揭示落叶松根际固氮菌的多样性及群落结构的季节变化规律,为森林生态系统的可持续发展提供理论依据。结果显示:(1)从阿尔山落叶松根际土壤中共计分离纯化细菌菌株112株,分属于14属41种,包括假单胞菌属、伯克氏菌属、根瘤菌属、叶杆菌属、节杆菌属、类芽孢杆菌属、沙雷菌属、欧文菌属、短小杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、柄杆菌属、红球菌属;其中优势菌群为假单胞菌属,次优势菌群为叶杆菌属、伯克氏菌属和节杆菌属。(2)季节变化对落叶松固氮菌群的变化有显著影响,表现为4月份和10月份最优势类群为γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)中的假单胞菌属,6月份和8月份的最优势类群相同,但组成有所差别,其中6月份优势菌群包括假单胞菌属、短小杆菌属、红球菌属、节杆菌属,8月份的优势菌群为假单胞菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、短小杆菌属、红球菌属和节杆菌属。(3)不同时期的物种均匀度指数(McIntosh index)差异显著,8月份最大,4月份最小,变化范围在0.83～1.164之间;物种丰富度指数(Shannon-Wiener index) 6月份和8月份显著高于4月份和10月份;优势度指数(Simpson index) 4月份和10月份显著高于6月份和8月份。研究表明,阿尔山地区落叶松根际微生物的多样性较高,群落相对复杂,分离的14个菌属多为根际促生菌,且不同时期固氮菌的群落组成受季节的影响明显。     

一株乙内酰脲酶产生菌Arthrobacter K1108的筛选及鉴定

从沈阳市浑河地区污泥中分离得到了一株乙内酰脲酶产生菌 ,薄层色谱和氨基酸自动分析仪的分析结果表明 ,该菌的完整细胞可催化 5 -苄基乙内酰脲水解产生苯丙氨酸。对该菌进行了细菌分类学鉴定 ,确定该菌为节杆菌属的一个种 ,故命名为 Arthrobacter sp.K1 1 0 8     

海生杆菌属的基因组测序数据分析

海生杆菌属首次于1997年鉴定,迄今包括18个物种,其中10个已完成全基因组序列测定。文中总结了海生杆菌属的菌种特征,并从碳源利用、聚羟基脂肪酸酯代谢和芳香族化合物降解三个方面对基因组测序数据进行了分析。研究发现,海生杆菌属具有完整的糖酵解途径和三羧酸循环,缺乏木糖利用基因。所有海生杆菌属菌种均含有Ⅰ型和Ⅲ型聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因,表明该菌属可能具有普遍的聚羟基脂肪酸酯合成能力。海生杆菌属含有芳香族化合物的降解途径,苯、苯酚和苯甲酸可由不同的酶催化生成邻苯二酚,再由邻位断裂途径降解为3-酮己二酸,邻苯二酚也可由间位断裂途径降解为丙酮酸和乙酰辅酶A。基因组测序数据分析加深了对海生杆菌属代谢特征的认识,提示该菌属在聚羟基脂肪酸酯合成和海洋芳香族污染物治理方面有一定的应用前景。     

食品上的应用

87182了采用产碱杆菌属菌种从马来酸酶法生产苹果酸〔英〕/Kim盯a,T.…了Agri。。Biol.Chem一1956,50(1)一59一94[译自CBA,1956,(7),2752〕 从上壤中分离到产碱杆菌属(Aleal‘g-ene:)T501菌株,该菌株具有从20%浓度的马来酸生产苹果酸的能力,其克分子产率为98.4%。分析反应混合液组分表明,马来酸通过马来酸异构酶和延胡索酸酶作用,经延胡索酸转变为L一苹果酸。这两种酶在细胞中是固有的,而与细胞中的碳源无关。通过添加2~疏基乙醇,可使酶反应大为增强,但添加谷胧甘肤或L一光胧氨酸则无影响。 (I劫田)871828采用热和微生物处理提高麦秸…     

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量, 对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造。首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控, 进而又敲除了tnaA基因, 阻断了色氨酸的分解代谢。然后, 将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达, 以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈。与对照MG1655相比, trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍, 双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍。pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168 mg/L, 而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后, 色氨酸浓度提高到820 mg/L。为构建色氨酸高产菌奠定了基础。