大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化和基本性质

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为ｐＨ８．３和ｐＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．０μｍｏｌ／Ｌ：Ｖｍａｘ为７６３０单位／毫克;ｋｏａｔ为９Ｓ－１。ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力对ＡＴＰ和Ａｒｇ的Ｋｍ分别为８．３ｍｍｏｌ／Ｌ和９９μｍｏｌ／Ｌ;Ｖｍａｘ为１６３２０单位／毫克;ｋｃａｔ为１８Ｓ－１。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡＡｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和１．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１６０００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为１６ｓ－１;ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力对精氨酸、ＡＴＰ和ＰＰｉ的Ｋｍ分别为９２．９μｍｏｌ／Ｌ、０．８５ｍｍｏｌ／Ｌ和８０．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为２８０００～３００００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为３２ｓ－１．ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的荧光激发光谱和发射光谱与ＡｒｇＲＳ基本相同。热失活速度比天然酶慢。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡ＾Ａｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子;得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量至少为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１、转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ、ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＲ分别为１．６５、２１０、１．８和３８单位／毫克。结果表明ＡｒｓＲＳ的Ｌｙｓ３０６为Ａｌａ取代使活力完全丧失;若被Ａｒｇ取代,则活力丧失８０％以上。Ｌｙｓ３０６为ＡｒｇＲＳ活力所必需。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶（ArgRS）及其变种的光谱学研究

本文用吸收光谱、溶剂微扰差光谱荧光光谱和ＣＤ光谱对天然酶ＡｒｇＲＳ及其变种酶ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ和ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的构象进行了研究,结果表明Ｌｙｓ３０６的突变引起变种酶分子表面的生色氨基酸残基所处微环境与天然酶梢有不同,ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ比ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ有更大的构象变化。变种酶ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ与天然酶的构象差别不大。ＣＤ光谱的分析显示转角在变种酶分子中依活力的下降二级结构中所占百分比下降。可以得出结论ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３０６所带的正电荷对维系ＡｒｇＲＳ的构象绝对重要,这种酶的构象变化引起变种酶的活力丧失;而ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３８１的改变则似乎不能引起酶构象的可觉察的变化。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子,得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量生活为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１,转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇ     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶（ArgRS）及其变种的光谱…

本文用吸收光谱，溶剂微据差光谱，荧光光谱和ＣＤ光谱对天然酶ＡｒｇＲＳ及其变种酶ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ，ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ和ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的构象进行了研究。结果表明Ｌｙｓ３０６的突变引起变种酶分子表面的生色氨基酸残然的处微环境与天然酶稍有不同，ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ比ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ有更大的构象变化。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶高表达条件的优化及酶…

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ＰＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒｇｓ变种ＡＲＧＳ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ柱层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条的纯酶,活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａ     

大肠杆菌亮氨酰－tRNA合成酶LeuRS67R的纯化及其动力学研究

本实验室已得到的亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）基因,与文献相比,６７位氨基酸残基由Ｈｉｓ变为Ａｒｇ,此酶被定名为ＬｅｕＲＳ６７Ｒ。我们从该基因与ｐＵＣ１９重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子ＴＧ１－９１中得到ＬｅｕＲＳ的高表达,粗抽液中ＬｅｕＲＳ的表达量在转化子中比在宿主菌ＴＧ１中高２０倍以上。用三步拉层析得到电泳一条带的酶,其比活为１７８９单位／毫克。测定其动力学常数,氨酰化活力对Ｌｅｕ、ＡＴＰ的Ｋｍ值分别为０．０２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４７ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｋｃａｔ值分别为３．５～５．１ｓ－１。ＡＴＰ－ＰＰｉ交换活力对Ｌｅｕ、ＡＴＰ的Ｋｍ值分别为０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｌｃａｔ值分别为１４０～１５５ｓ－１。此结果与从野生型大肠杆菌Ｋ－１２中提纯的ＬｅｕＲＳ的动力学常数差别很小,６７位氨基酸残基在与活性中心无直接关系的域可能是大肠杆菌的种间差异。     

大肠杆菌JM83精氨酰－tRNA合成酶基因的克隆、测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板,扩增了精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）基因。将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中,得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。粗抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力,ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ和２１０Ｕ／ｍｇ,后者为前者的１２７倍。ＤＮＡ顺序测定表明,与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ,这种变化使ＡｒｇＲＳ的３０５位氨基酸残基由Ｇｌｎ变为Ｌｙｓ,但这种改变不影响酶的活力。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶高表达条件的优化及酶的纯化

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ｐＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉａｒｇｙ变种ａｒｇｒ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条带的纯酶活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａｒｇｓ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中提纯Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｓＲＳ的通用方法。     

鸭肫平滑肌肌球蛋白的提纯及其ATP酶性质的研究

从鸭肫肌肉中分离纯化了平滑肌肌球蛋白,并对平滑肌肌球蛋白分子的亚单位组成和平滑肌肌球蛋白的ＡＴＰ酶性质进行了分析研究。鸭肫平滑肌肌蛋白的Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶活力与溶液的离子强度有关。在低于０．２０ｍｏｌ／Ｌ的ＫＣＬ浓度时,酶活力很低;大于０．３０ｍｏｌ／Ｌ的ＫＣＬ浓度时,酶活力较高,Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶有两个最适ｐＨ值。Ｋ＾＋／ＥＤＴＡ－ＡＴＰ酶活力随ＫＣＬ浓度升高而增加。肌动蛋白激活的磷酸化肌球     

L－NNA和还原型Hb对SHRsp肠系膜动脉内皮依赖性舒张的影响

我们以往的工作证实成年自发高血压大鼠（ＳＨＲ与ＳＨＲｓｐ）肠系膜动脉由乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张（ＥＤＲ）减弱。为进一步探讨ＥＤＲ减弱的机制，本文观察了一氧化氮（ＮＯ）合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸（Ｌ－ＮＮＡ）及ＥＤＲＦ灭活剂还原型血红蛋白（ＲＨｂ）对卒中易感型自发高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）与常压对照（ＷＫＹ）大鼠肠系膜动脉ＡＣｈ内皮依赖性舒张（ＥＤＲ）的影响。发现Ｌ－ＮＮＡ（１０（－３）ｍｏｌ／Ｌ）可使ＳＨＲｓｐ弱于ＷＫＹ的ＡＣｈＥＤＲ（１０（－８）－１０（－５）ｍｏｌ／Ｌ）的差异消失，ＲＨｂ（１０（－５）ｍｏｌ／Ｌ）则仅在１０（－７）－１０（－８）ｍｏｌ／ＬＡＣｈ时使ＳＨＲ（ｓｐ）肠系膜动脉ＥＤＲ弱于ＷＫＹ的差异消失。将ＷＫＹ在加入Ｌ－ＮＮＡ后的与加入ＲＨｂ后的ＡＣｈ（１０（－８）－１０（－５）ｍｏｌ／Ｌ）ＥＤＲ进行比较，无显著差异。而将ＳＨＲｓｐ在Ｌ－ＮＮＡ后的与ＲＨｂ后的ＡＣｈ（１０（－８）－１０（－６）ｍｏｌ／Ｌ）ＥＤＲ进行比较，则有显著差异。并且，ＳＨＲｓｐ的有内皮肠系膜动脉条对ＲＨｂ的敏感性与ＷＫＹ接近，对Ｌ－ＮＮＡ的敏感性则低于ＷＫＹ。表明高血压时肠系膜动脉内皮依赖性舒张减弱中，ＥＤＲＦ机制与     

胞外青霉素酰化酶的纯化及部分理化性质

巨大芽孢杆菌产胞外青霉素酰化酶发酵液经硫酸铵分级抽提及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００、羟基磷灰石、ＤＥＡＥ纤维素ＤＥ５２等层析步骤,提纯了青霉素酰化酶,得到电泳均一的酶制剂。纯酶比活力约为２５Ｕ／ｍｇ蛋白,纯化４９倍,活力回收５８％,经ＰＡＧＥ及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测知该酶不含亚基,其分子量约为１４０ｋＤ。该酶最适ｐＨ为９．０,最适温度４７℃,用底物ＮＩＰＡＢ测活,其Ｋｍ值为６．２×１０~（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍ值为１．２４×１０４ｍｏｌ／Ｌ。此外还探讨了部分金属离子对该酶的影响。     

胞外青霉素酰化酶的纯化及部分理化性质

巨大芽孢杆菌产胞外青霉素酰化酶发酵液经硫酸铵分级抽提及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００、羟基磷灰石、ＤＥＡＥ－纤维素ＤＥ５２等层析步,提纯了青霉素酰化酶,得到电泳均一的酶制剂,纯酶比活力约为２５Ｕ／ｍｇ蛋白,纯化４９倍,活力回收５８％,经ＰＡＧＥ及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测知该酶不含亚基,其分子量约为１４０ｋＤ。该酶最适ｐＨ为９．０,最适温度４７℃,用底物ＮＩＰＡＢ测活,其Ｋｍ值为６．２×１０＾－４ｍｏｌ／Ｌ     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α－半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶、α－和β－半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示１条蛋白质带,在α－半乳糖苷酶浓度为１５０ｍＵ／ｍｌ的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α－半乳糖苷酶的分子量用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤柱测定或在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测定均为６０ｋＤ,酶反应的最适ｐＨ在５．８附近,最适温度为６０℃。该酶分解对硝基苯基－α－半乳糖苷的Ｋ＿ｍ值为３．７×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖ＿ｍ值为２．１×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ。银离子、汞离子显著抑制酶活力,Ｄ－半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α－Ｄ－半乳糖苷的活力,根据Ｄｉｘｏｎ作图求得其Ｋ＿ｉ值分别为０．９２×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ和１．９８×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ。２－脱氧－Ｄ－半乳糖和Ｌ－岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰     

大肠杆菌JM83精氨酰—tRNA合成酶基因的克隆,测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板,扩增了精氨酰ｔ－ＲＮＡ合成酶基因,将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中,得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。精抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力,ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ。后者为前者的１２７倍,ＤＮＡ顺序测定表明,与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ,这种变化使ＡｒｇＲＳ的     

牛脑V型质子转运ATP酶复合体依赖于温度的活性变化

在ＫＣ１介质中牛脑Ｖ－型质子转运ＡＴＰ酶复合体活力温度的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图在３３℃附近呈现明显的折点,同样做其Ｎ－［１－芘］马来酰亚胺（Ｎ－［１－Ｐ］Ｍ）的荧光－温度的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图,发现其折点温度也为３３℃,当加入１００μｍｏｌ／Ｌ ＮＥＭ（Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）,ＡＴＰ酶复合体活力部分被抑制后的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图折点下降为２７℃,加入０．７５－０．８５ｍｏｌ／Ｌ尿素则活力     

《游蛇科锦蛇属（Elaphe Fitzinger）专著》［德］

《游蛇科锦蛇属（ＥｌａｐｈｅＦｉｔｚｉｎｇｅｒ）专著》［德］ＡＭＯＮＯＧＲＡＰＨＯＦＴＨＥＣＯＬＵＢＲＩＤＳＮＡＫＥＳＯＦＴＨＥＧＥＮＵＳＥＬＡＰＨＥＦＴＴＺＩＮＧＥＲＫｌａｕｓ．Ｄｉｅｔｅｒ＆ｈｏｂ著。德国印制,捷克ＫｏｅｌｔＺ勤ｉｅｎｎｄＣＤ刀ｂ...     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys378和381的点突变研究

用点突变的方法将大肠杆菌精氨酰—ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因ａｒｇｓ上相应于Ｌｙｓ３７８和Ｌｙｓ３８１的密码ＡＡＡ分别变为两氨酸的密码ＧＣＡ和精氨酸的密码子ＣＧＴ,得到了４个ａｒｇｓ的突变体ａｒｇｓ３７８ＫＡ,ａｒｇｓ３７８ＫＲ,ａｒｇｓ３８１ＫＡ和ａｒｇｓ３８１ＫＲ,将它们分别连接到ｐＵＣ１８上,转入大肠杆菌ＴＧ１,在ＴＧ１转化子中,ＡｒｇＲＳ及其变种的表达量约为ＴＧ１中的１２０倍以上。结果表明Ｌｙｓ３７８为Ａｒｇ和Ａｌａ取代分别使活力下降０％和１０％;Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ和Ａｒｇ后,活力分别下降３３％和１０％左右。Ｌｙｓ３７８不为酶活力必需。Ｌｙｓ３８１部位的正电荷对酶活力是重要的。