玉米转座因子Ac／Ds导入水稻花药悬浮细胞并再生成植株

使用电激法将分别含玉米转座因子ＡＣ或Ｄｓ因子的质粒ＤＮＡ同时导入水稻花药悬浮系细胞团,得到转化抗性意伤组织,并分化成可育植株。对一些植株的ＤＮＡ进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析和ＰＣ且扩增,发现导入的外源ＤＮＡ已整合到了水稻染色体上而且Ｄｓ因子已发生了转座。抗性测定表明转化植株Ｆ１代和Ｆ２代种子中的大多数仍有Ｄｓ因子存在。     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的,为此目的,将玉米的Ｄｓ因子及ｂａｒ基因连接至载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００的Ｔ－ＤＮＡ区域中,构建成重组Ｔｉ质粒ｐＤｓＢａｒ１３００。ｐＤａＢａｒ１３００中Ｔ－ＤＮＡ区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的。为此目的,将玉米的Ds因子及bar基因连接至载体pCAMBIA1300的T-DNA区域中,构建成重组Ti质粒pDsBar1300。pDsBar1300中T-DNA区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标记。插入在Ds因子中的bar基因可追踪转化后代的Ds因子。pDsBar1300通过根瘤农杆茵介导引入水稻品种中花11号的幼胚组织。从各转化愈伤组织中获得了1400株独立的Ds水稻转化植株。通过PPT抗性检测和PCR分析证明了水稻转化植株中Ds因子的整合。Southernblot分析了转化植株基因组中Ds因子的插入拷贝数,其中单拷贝插入比率约占70％。这些插有Ds因子的水稻转化植株,当引入自主型的Ac因子反式活化Ds因子后,可使Ds因子跳跃到不同位点上,就可得到更多的突变植株。     

外源DNA直接导入小麦及其在育种上的应用

本研究选用两个白粒小麦品种作供体,提取其总ＤＮＡ,采用花粉管直接携带法导入７５（１９８）红粒品种受体植株。ＤＮＡ导入的第一代（Ｄ１）,目的性状的转化频率为１．７５％和２．９４％。Ｄ２代变异率显著低于Ｄ１代。对Ｄ１,Ｄ２代所得目的性状变异后代,按照常规育种程序进行Ｄ３代观察与鉴定,得到已稳定遗传的后代,从中选取保持原品种其它优良性状而籽粒为的白色的变异类型混合脱粒,获得７５（１９８）改良新品系。     

玉米Ac双因子转座标签系统的构建及其转化烟草后代的遗传分析

用使质粒pKU3所携带的玉米Ac因子的5'末端和中间编码转座酶的基因片段分别发生缺失的方法构建成质粒pKU3（△B）和pKU3（△H）。质粒所携带缺失的Ac因子单独存在时都无自主转座能力,但当Ac（△H）和Ac（△B）共存于一个细胞时,由于Ac（△B）产生转座酶的互补作用促使Ac（△H）恢复转座能力,而当Ac（△B）和Ac（△H）因子被分离后即获得Ac（△H）因子的稳定插入突变株,它可克服因突变不稳定而给用转座因子标签法分离基因所造成的困难。将双因子系统导入烟草原生质体并获得再生植株,从而选得卡那霉素抗性植株,显示Ac（△H）因子已经从原质粒上的NPTⅡ前导顺序中切离。Sortharnblot和PCR分析表明：Ac（△H）和Ac（△B）因子已经整合在转化烟草的基因组并能遗传至F1和F2代植株中;有些植株后代中已检测不到Ac（△B）因子的存在,说明它们的Ac（△B）因子已与Ac（△H）因子相分离;各转化植株中Ac（△H）因子在基因组中的插入拷贝数从一个到几个不等;初步显示Ac（△H）因子多数插入或转座在基因组的结构基因中。     

导入小麦加倍单倍体植株的玉米DNA在后代中的遗传及序列同源性分析

作者曾报道了一个玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）基因组特异的重复序列ＤＮＡ（克隆ＭＲ６４）通过小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｖａｖ．ｅｘ Ｚｈｕｋ．）与玉米杂交导入一个小麦加倍单倍体（ＤＨ）植株中。利用分析主宰该重复ＤＮＡ序列可以稳定地传递到小麦ＤＨ３代植株。通过Ｉｎｔｅｒｍｅｔ在ＤＮＡ数据库中进行序列相似性搜寻和同源性比较,结果显示,ＭＲ６４的ＤＮＡ序列和玉米的最近报道的两个逆转座子Ｐ     

抗atrazine转基因大豆的抗性遗传及某些生理、农艺性状

抗ａｔｒａｚｉｎｅ基因导入大豆植株后不仅在Ｆ１代获表达,且已遗传到后代（１９９年已至Ｆ７代）。通过正交与反交试验证明,其Ｆ１代植株对ａｔｒａｚｉｎｅ的抗性性状均与其母本性状一致,即该性状为母系遗传,为细胞质基因,位于叶绿体ＤＮＡ上。通过导入抗性基因株与未导入抗性基因的对照株的光合速率测定、成分分析及农艺性状（株高、百粒重、单株产量）测定表明,两类植株间无明显差异。在喷施ａｔｒａｚｉｎｅ情况下,转基因株能表现出抗性。     

不同启动子控制下Ac转座酶基因的表达对玉米Ds因子在水稻中切离频率的影响

用水稻愈伤组织比较了Ac启动子、35S启动子与Ubi启动子控制下Ac转座酶基因（Ts）的表达对Ds因子切离频率的影响。结果表明Ubi启动子与Ac转座酶编码区嵌合基因（Ubipro-Ts)反式激活Ds因子的切离频率最高,达到了72．9％。通过杂交将Ubipro-Ts基因导入Ds因子转化植株,得到9株Ubipro-Ts基因与Ds因子共存的F1代杂交水稻植株,其中有8株Ds因子发生了切离。用Inverse-PCR的方法从其中一株杂交植株中克隆到Ds因子的旁邻序列,其DNA顺序与亲本中Ds因子原插入位点的序列不同,表明Ds因子转座到了新的基因组位点。     

不同启动子控制下Ac转座酶基因的表达对玉米Ds因子在水稻中切离频率的影响

用水稻愈伤组织比较了Ac启动子、35S启动子与Ubi启动子控制下Ac转座酶基因（Ts）的表达对Ds因子切离频率的影响。结果表明Ubi启动子与Ac转座酶编码区嵌合基因（Ubipro-Ts）反式激活Ds因子的切离频率最高,达到了72.9%。通过杂交将Ubipro-Ts基因导入Ds因子转化植株,得到9株Ubipro-Ts基因与Ds因子共存的F1代杂交水稻植株,其中有8株Ds因子发生了切离。用Inverse-PCR的方法从其中一株杂交植株中克隆到Ds因子的旁邻序列,其DNA顺序与亲本中Ds因子原插入位点的序列不同,表明Ds因子转座到了新的基因组位点。     

导入bar基因的水稻新植株可遗传

江苏省农业科学院粮作所王才林、赵凌、宗寿余等和中科院上海生化所龚蓁蓁等9位科研人员,用花粉管通道法将bar基因导入水稻获得可遗传的转基因植株。亦即他们利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系E32,获得转基因植株。但在T0代仅表现为部分抗性,T1代全部获得了抗性,T3代全部转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性。通过对转基因植株后代进行PCR分析,证实了bar基因已整合到受体植株的基因组之中,以后又经过遗传分析表明,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代植株,并在T3代开始就可分离出抗性一致的稳定株系。目前,其…     

农杆菌转化获得转B.t.基因水稻及其生物学鉴定

以水稻主栽品种“秀水１１”和“春江１１”预培养４ｄ未成熟胚为转化受体,经农杆菌ＬＢＡ４４０４／ｐＧＢＩ４Ａ２Ｂ（含Ｂ．ｔ．基因）感染后,筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生频率达４４％￣７０％,转化植株产生频率达２７％￣６４％。转基因植物总ＤＮＡ经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交试验表明,Ｔ－ＤＮＡ上的外源基因已整合到水稻的基因组里。对转Ｂ．ｔ．基因水稻植株进行了两种水     

抗atrazine转基因大豆的抗性遗传及某些生理,农艺性状

抗ａｔｒａｚｉｎｅ基因导入大豆植株后不仅在Ｆ１代获表达,且已遗传到后代。通过正交与反交试验证明,其Ｆ１代植株对ａｔｒａｚｉｎｅ的抗生性状均与其母本性状一致,即该性状为母系遗传,为细胞质基因,位于叶绿体ＤＮＡ上。通过导入抗生基因株与未导入抗性基因的对照株的光合速率测定、成分分析及农艺性状测定表明,两类植株间无明显差异。在喷施ａｔｒａｚｉｎｅ情况下,转基因株能表现出抗性。     

抗菌肽B基因导入水稻及转基因植株的鉴定

构建了一个适合在水稻中表达的含有抗菌肽B基因的转化载体(pCB1),应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚,获得了一些转基因水和植株.Basta抗性鉴定,抗菌肽B基因PCR扩增分析,点渍印迹和Southern印迹分析结果表明,选择标记基因(bar)和抗菌肽B基因都已整合入转化水稻基因组中,Northern印迹分析证实了抗菌肽B基因在RNA水平上的表达.转基因水稻植株增强了对水稻白叶枯病和细条病的抗性.     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

CHI-PAT双价基因遗传转化贵州禾来拢

以贵州禾来拢幼胚为转化受体,用农杆菌介导法将几丁质酶和抗除草剂抗性双价基因(CHI-PAT)导入来拢幼胚,筛选出抗性愈伤组织并获得抗性植株.抗性植株经GUS组织化学及PCR检测呈阳性,转基因植株对50 mg/L的Basta溶液有抗性.初步证明CHI和PAT基因已整合进了水稻基因组中.     

新霉素抗性基因在家蚕中的插入和表达

构建含新霉素抗性基因（ｎｅｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ,ｎｅｏＲ）的重组质粒ｐＦＮ,经ＨｉｎｄＩＩ酶切后,用基因枪将ＤＮＡ片段导入家蚕早期受精卵中（Ｇ０代）。孵化的Ｇ１、Ｇ２代蚁蚕均经含新霉素的人工饲料添食２４ｈ后,筛选出新霉素抗性的个体（能正常生长发育的）改为桑叶饲养。于Ｇ２代的５龄第二天从后部丝腺抽提总ＤＮＡ,再以ｎｅｏＲ的ｃＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测。结果表明ｎｅｏＲ基因已转入家蚕ＤＮＡ中,获得了含ｎｅｏＲ的转基因蚕。     

Ac/Ds(GUS)结构介导的水稻启动子捕获系统的建立

构建了基于Activator/Dissociation(β-glucuronidase)[简称Ac/Ds(GUS)]结构的捕获质粒p13B,用于分离水稻基因启动子.以此质粒用衣杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,对获得的18个独立转化株的T2代植株进行了抗除草剂筛选,从141个抗除草剂转基因植株中用PCR方法检测到其中37株是Ds因子发生了转座的植株,而且这种转座到新位置上的Ds因子是遗传的.初步观察到其中5株的GUS染色呈阳性.     

根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立

比较了影响根癌农杆菌转化水稻的各种因素后,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。按该体系,水稻品种中花11号预培养4d的幼胚经农杆菌EHA105／pCAMBIA1301感染后,具有GUS基因瞬间表达的幼胚比例在50％以上,最高可达90％;按产生潮霉素抗性愈伤和转基因植株的比例计算,转化率分别达到87．6％和64．6％。转基因植株总DNA的Southern杂交分析表明T－DNA上的外源基因已整合进了水稻基因组,且在大多数转基因植株中表现为单拷贝插入;遗传分析证明T1代的表型分离符合孟德尔法则。此转化系统的建立为高效地将有用的外源DNA导入水稻植株奠定了基础。     

石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生

以石防风（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｅｕｍ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｆｉｓｃｈ．ｅｘＴｕｒｃｚ．）叶柄愈伤组织为材料建立以致密细胞团为主的悬浮培养物,用酶解法获得原生质体。用ＰＥＧ法将拟南芥菜（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）抗除草剂基因导入原生质体后进行液体浅层培养。转化细胞经除草剂ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ筛选,通过胚状体途径产生抗性小植株。转化处理１０６个原生质体,以加入４０～５０μｇ／ｍＬ质粒ＤＮＡ,ＰＥＧ终浓度为１０％,于１ｍＬ转化介质中,２６℃黑暗下处理２０ｍｉｎ的效果最好。ｃｔＤＮＡ的加入对转化结果无明显影响。分子杂交试验表明,突变的ａｌｓ基因已整合进转化植株的基因组中。转基因植株的细胞在脱分化过程中仍具有抗ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ的能力;移栽成活的转基因小苗仍表现出抗除草剂特性,而未转化的植株在低浓度除草剂下即逐渐死亡。表明转入的ａｌｓ基因在石防风细胞内能够稳定表达。