细胞生长和表面精蛋白的N－糖链中核心岩藻糖的关系

细胞生长和表面精蛋白的Ｎ－糖链中核心岩藻糖的关系董素才,杨小平,陈惠黎（上海医科大学生物化学教研室,２０００３２）关键词精蛋白Ｎ—糖链,核心岩藻糖,小扁豆凝集素,细胞生长细胞表面精蛋白Ｎ一糖链的结构与细胞生长、分化、恶变有密切关系,除糖链的类型和天线...     

N—糖链在细胞粘附中的作用

参与细胞与细胞,细胞与基质相互作用的细胞粘附分子均为含Ｎ－糖链的蛋白,Ｎ－糖链在细胞的识别、粘附过程中起一定的作用。本文就纤维蛋白、层粘连蛋白、整合蛋白、选择蛋白和凝集素受体等分子中Ｎ－糖链与细胞识别和粘附关系加以讨论。     

佛波酯能改变细胞表面糖蛋白N—糖链的结构

利用标记Ｎ－糖链的凝集素亲和层析法研究了佛波醇肉桂酸乙酸酯对人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１表面糖蛋白上Ｎ－糖链结构的影响,发现１００ｎｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＡ处理５天后,可使细胞表面Ｎ－糖链中高甘露糖型和杂合型以及四天线,Ｃ２Ｃ２,６三天线复杂型的比例增高,而二天线复杂型降低,此结果与我们曾报道的视黄酸和双丁酰环磷酸腺苷对该细胞表面Ｎ－糖链的影响相反。因ＲＡ和ｄｂ－ｃＡＭＰ是ＳＭＭＣ－７７２１细胞的分化诱     

细胞表面糖链末端唾液酸和岩藻糖和某些细胞生物学行为的关系

用神经氨酸酶和α-L-岩藻糖苷酶分别切除人肝癌细胞株7721细胞表面糖链中的末端唾液酸（SA）和岩藻糖（Fuc)残基来研究表面聚糖结构和某些细胞生物学行为之间的关系。选择细胞对纤连蛋白（Fn）,层黏蛋白（Ln)和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附能力,细胞趋化性迁移以及趋化性侵袭作为细胞行为的指标。结果表明：表面人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附能力,细胞趋化性迁移以及趋化性侵袭作为细胞行为的指标。结果表明：表面糖链末端SA对细胞黏附至Fn并不必需,对细胞黏附至Ln和细胞的趋化性侵袭却至为重要,而对细胞黏附至HUVEC以及趋化性迁移则为关键性残基。与SA相比,Fuc可能参与细胞Fn,Ln和HUVEC的黏附,但对趋化性迁移以及趋化性侵袭并不重要。细胞对HUVEC的黏附以及趋化性迁移和侵袭可被唾液酸化Lewis X(SLe^x)单抗抑制,但不被未唾液酸化的Lewis X(Le^x)单抗抑制,这一结果支持SA在上述三种细胞过程中Fuc残基重要。     

佛波酯能改变细胞表面糖蛋白N－糖链的结构

利用标记Ｎ－糖链的凝集素亲和层析法研究了佛波醇肉桂酸乙酸酯（ＰＭＡ）对人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１表面糖蛋白上Ｎ－糖链结构的影响,发现１００ｎｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＡ处理５天后,可使细胞表面Ｎ－糖链中高甘露糖型和杂合型以及四天线、Ｃ２Ｃ２,６三天线复杂型的比例增高,而二天线复杂型降低。此结果与我们曾报道的视黄酸（ＲＡ）和双丁配环磷酸腺苷（ｄｂ－ｃＡＭＰ）对该细胞表面Ｎ－糖链的影响相反。因ＲＡ和ｄｂ－ｃＡＭＰ是ＳＭＭＣ－７７２１细胞的分化诱导剂,可抑制细胞生长;而ＰＭＡ是该细胞的增殖促进剂,故细胞表面Ｎ－糖链的变化与细胞的分化和增殖密切相关。     

N─糖链在细胞粘附中的作用

参与细胞与细胞,细胞与基质相互作用的细胞粘附分子均为含N─糖链的糖蛋白,N─糖链在细胞的识别、粘附过程中起一定的作用。本文就纤连蛋白、层粘连蛋白、整合蛋白、选择蛋白和凝集素受体等分子中N─糖链与细胞识别和粘附关系加以讨论。     

视黄酸对人肝癌细胞表面N糖链类型及天线数的影响

本文采用系列凝集素柱层析法,并配合外切糖苷酶处理研究了在视黄酸作用１－５天过程中人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１细胞表面Ｎ糖结构的变化。结果表明,ＲＡ促进＾３Ｈ－甘露糖参入细胞表面Ｎ糖链,使高甘露糖型Ｎ糖的百分比下降,复杂型百分比长升,并促进二天线Ｎ糖链的生物合成,使多天线特别是四天线和Ｃ２,Ｃ２１ｂ三天线Ｎ糖链的合成减少。结果提示,Ｎ糖链结构的这些变化可能是ＲＡ诱导ＳＭＭＣ－７７２１细胞向正常方向     

细胞表面糖链末端唾液酸和岩藻糖与某些细胞生物学行为的关系

用神经氨酸酶和a-L-岩藻糖苷酶分别切除人肝癌细胞株7721细胞表面糖链中的末端唾液酸(SA)和岩藻糖(Fuc)残基来研究表面聚糖结构和某些细胞生物学行为之间的关系.选择细胞对纤连蛋白(Fn)、层黏蛋白(Ln)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的黏附能力、细胞趋化性迁移以及趋化性侵袭作为细胞行为的指标.结果表明表面糖链末端SA对细胞黏附至Fn并不必需,对细胞黏附至Ln和细胞的趋化性侵袭却至为重要,而对细胞黏附至HUVEC以及趋化性迁移则为关键性残基.与SA相比,Fuc可能参与细胞Fn、Ln和HUVEC的黏附,但对趋化性迁移以及趋化性侵袭并不重要.细胞对HUVEC的黏附以及趋化性迁移和侵袭可被唾液酸化Lewis X(SLex)的单抗抑制,但不被未唾液酸化的Lewis X(Lex)单抗抑制,这一结果支持SA在上述三种细胞过程中较Fuc残基重要.     

糖蛋白糖链的分析

糖蛋白是蛋白与糖类的共价复合物,结合于蛋白肽链上的糖链具有重要的生物学功能。对糖蛋白上的糖链进行分析,要经过糖链释放、分离不同类型糖链、相对分子质量测定及糖链测序等步骤。本简要介绍糖蛋白糖链分析各步骤的常用方法、各种方法的特点、适用范围等。     

岩藻糖糖链与肝癌细胞的迁移作用

通过凝集素印迹转移电泳和亲和层析技术,对岩藻糖糖基化蛋白在肝癌细胞中的作用进行了研究.在化学诱发的大鼠肝癌过程中, 分子质量在23 ku到40 ku范围内与荆豆凝集素(UEA)及扁豆凝集素(LCA)结合的岩藻糖糖基化蛋白显著减少, 诱癌至17～20周这些条带重新恢复,而分子质量为80 ku的条带却在诱癌过程中逐周增加.比较高、低转移性肝癌细胞的岩藻糖糖基化蛋白, 发现高转移性肝癌细胞具有多种增强的条带.利用橘果粉胞凝集素(AAL)和LCA亲和层析柱分离了这些岩藻糖基化糖蛋白, 并用这些糖蛋白直接作用于肝癌细胞,发现AAL-糖蛋白具有显著抑制肝癌细胞迁移的作用,迁移细胞数从对照的(100±4.9)%下降到(48.1±2.5)% (P＜0.01), LCA-糖蛋白也有类似作用.用胰酶和木瓜蛋白酶水解蛋白质部分后,形成的糖肽抑制肝癌细胞迁移的作用并不改变,甚至增强.此外直接用肝癌转移灶的组织测定了岩藻糖转移酶活性,发现α1,6岩藻糖基转移酶活性显著比正常肝组织高,而α1,3岩藻糖基转移酶活性没有显著的改变.用系列凝集素分析发现这些糖链主要能结合伴刀豆凝集素A, 也能结合E-型及L-型植物凝集素, 显示这种糖蛋白的糖链可能含有较多的高甘露糖型.这些结果提示糖链在诱癌过程中结构有了改变,使之在肝癌细胞的迁移和转移中起重要作用.     

N—糖链在纤连蛋白分泌及纤连蛋白受体与配体结合的作用

应用能断糖蛋白Ｎ－糖链合成的衣霉素（ＴＭ）,研究了Ｎ－糖链缺失对ＨＴ１０８０细胞分泌纤连蛋白（Ｆｎ）以及纤连蛋白受体（ＦｎＲ）与配体结合的影响。结果表现,１μｇ／ｍｌ的ＴＭ可抑制Ｎ－糖链的合成（此时,３Ｈ－甘露糖掺入下降６３％）,但细胞分泌Ｆｎ的量仅下降３％,这主要是由于蛋白合成受ＴＭ抑制（２５％）而引起。因而,Ｎ－糖链缺失可能并不影响Ｆｎ的分泌,而在同样条件下,单个细胞结合１２５Ｉ－Ｆｎ的量显著     

人胚肺成纤维细胞株纤连蛋白结构域N—糖链结构研究

本文应用明胶、肝素亲和层析二步法首先纯化了人胚肺成纤维细胞培养液的纤连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,Ｆｎ）,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为一条带,然后用胰糜蛋白酶消化纯化的Ｆｎ所获得的酶解液,经分离分别得到明胶结合片段和肝素结合片段,再应用凝集素－ＨＲＰ染色的Ｗｅｓｔｅｒｎ转移电泳法研究糖链结构,结果证实：１．Ｆｎ中明胶结合片段（４４ｋｄ）中含有二天线和多天线复杂型糖链,并接有平分型ＧｌｃＮＡｃ糖基、核     

视黄酸对人肝癌细胞表面N糖链类型及天线数的影响

本文采用系列凝集素柱层析法,并配合外切糖苷酶处理研究了在视黄酸(RA)作用1—5天过程中人肝癌细胞株SMMC-7721细胞表面N糖链结构的变化。结果表明,RA促进3~H-甘露糖(Man)参入细胞表面N糖链,使高甘露糖型N糖链的百分比下降,复杂型百分比上升,并促进二天线N糖链的生物合成,使多天线特别是四天线和C_2,C_(21)b三天线N糖链的合成减少。结果提示,N糖链结构的这些变化可能是RA诱导SMMC-7721细胞向正常方向分化的结果。     

基于超滤膜辅助的糖蛋白全N-连接糖链的富集和质谱解析

糖基化作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,对蛋白质的空间结构、生物功能等具有重要的影响.解析糖蛋白糖链结构有助于更清楚地认识糖蛋白及其功能.本研究建立了一种基于超滤膜富集血清中糖蛋白全N-连接糖链,并利用质谱技术对糖链结构进行分析的方法.根据糖蛋白及其糖链结构之间的分子质量差异,利用Millipore公司的10 ku超滤膜富集血清糖蛋白上酶解(PNGase F)释放的全N-连接糖链,并使用MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链结构.通过该技术可以从血清中富集并鉴定到23种独特的N-连接的糖链结构,并且利用二级质谱进行了结构确认.该方法可以被用于从大量生物样本中富集糖蛋白全N-连接糖链,可以达到快速、高通量地解析糖蛋白N-连接糖链的目的.     

人胎盘纤维蛋白N糖链结构研究

分离纯化了人胎盘纤连蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为一条带,纯化Ｆｎ仍保持其搞原性,得率为３８．７％。根据植物凝集素识别专一糖链结构的原理,应用斑点印迹法。亲和层析法和Ｗｅｓｔｅｒｎ转移电泳研究糖链结构,结果证实：１．人胎盘Ｆｎ分子中含有复杂Ｎ糖链（包括二天线和大于二天线的结构）以及高甘露糖型和／或杂合型Ｎ糖链;复杂型Ｎ糖糖链中含有平分型ＧｌｃＮＡｃ,糖链末端也可连有唾液酸;２．胰糜蛋白酶水解而获得     

N-糖链合成抑制剂对NIH3T3细胞粘附作用和整合蛋白表达的影响

研究了Ｎ－糖链合成抑制剂——Ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＭＭ）和衣霉素（ＴＭ）对ＮＩＨ３Ｔ３细胞粘附作用和细胞表面α５β１整合蛋白含量的影响．研究结果发现甘露糖苷酶Ⅰ抑制剂－ＤＭＭ处理ＮＩＨ３Ｔ３细胞后,３Ｈ－甘露糖（３Ｈ－Ｍａｎ）参入ＮＩＨ３Ｔ３细胞较对照细胞增加一倍,多天线复杂型糖链增加１８％,而细胞表面α５β１整合蛋白与纤连蛋白粘附能力却下降１７％,但对膜整合蛋白α５和β１亚基表达量无明显影响,提示不成熟的糖链对整合蛋白参与的细胞粘附功能有一定影响,但不影响糖蛋白运输及整合到膜上．十四糖二磷酸长萜醇合成抑制剂——ＴＭ为０．５μｇ／ｍｌ时,Ｎ－糖链合成显著抑制,３Ｈ－Ｍａｎ参入减少了５２％,细胞粘附能力下降了３７％,细胞表面膜整合蛋白α５亚基下降了２２％,而β１亚基无明显变化,提示ＴＭ的脱糖基化作用可引起α５亚基转运至细胞膜表面下降,以至影响了细胞的粘附能力．此外,脱糖整合蛋白与纤连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,Ｆｎ）的结合力下降也是原因之一．     

人胎盘纤连蛋白N糖链结构研究

分离纯化了人胎盘纤连蛋白（Ｆｎ）,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为一条带,纯化Ｆｎ仍保持其搞原性,得率为３８．７％。根据植物凝集素识别专一糖链结构的原理,应用斑点印迹法,亲和层析法和Ｗｅｓｔｅｒｎ转移电泳研究糖链结构,结果证实：１．人胎盘Ｆｎ分子中含有复杂型Ｎ糖链（包括二天线和大于二天线的结构）以及高甘露糖型和／或杂合型Ｎ糖链;复杂型Ｎ糖链中含有平分型ＧｌｃＮＡｃ,糖链末端也可连有唾液酸;２．胰糜蛋白酶水解而获得的明胶结合片段（４４ｋＤ）含有二天线和多天线复杂型糖链,也可接有平分型ＧｌｃＮＡｃ;３．肝素结合片段（３０ｋＤ）以及明胶、肝素均不结合的Ｆｎ片段不含有多天线复杂型Ｎ糖链。