大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶高表达条件的优化及酶的纯化

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ｐＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉａｒｇｙ变种ａｒｇｒ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条带的纯酶活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａｒｇｓ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中提纯Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｓＲＳ的通用方法。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶（ArgRS）及其变种的光谱学研究

本文用吸收光谱、溶剂微扰差光谱荧光光谱和ＣＤ光谱对天然酶ＡｒｇＲＳ及其变种酶ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ和ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的构象进行了研究,结果表明Ｌｙｓ３０６的突变引起变种酶分子表面的生色氨基酸残基所处微环境与天然酶梢有不同,ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ比ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ有更大的构象变化。变种酶ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ与天然酶的构象差别不大。ＣＤ光谱的分析显示转角在变种酶分子中依活力的下降二级结构中所占百分比下降。可以得出结论ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３０６所带的正电荷对维系ＡｒｇＲＳ的构象绝对重要,这种酶的构象变化引起变种酶的活力丧失;而ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３８１的改变则似乎不能引起酶构象的可觉察的变化。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡ＾Ａｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡＡｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和１．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１６０００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为１６ｓ－１;ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力对精氨酸、ＡＴＰ和ＰＰｉ的Ｋｍ分别为９２．９μｍｏｌ／Ｌ、０．８５ｍｍｏｌ／Ｌ和８０．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为２８０００～３００００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为３２ｓ－１．ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的荧光激发光谱和发射光谱与ＡｒｇＲＳ基本相同。热失活速度比天然酶慢。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子;得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量至少为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１、转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ、ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＲ分别为１．６５、２１０、１．８和３８单位／毫克。结果表明ＡｒｓＲＳ的Ｌｙｓ３０６为Ａｌａ取代使活力完全丧失;若被Ａｒｇ取代,则活力丧失８０％以上。Ｌｙｓ３０６为ＡｒｇＲＳ活力所必需。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化…

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ－ＰＰｉ交换活力的最适ＰＨ分别为ＰＨ８．３和ＰＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化和基本性质

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为ｐＨ８．３和ｐＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．０μｍｏｌ／Ｌ：Ｖｍａｘ为７６３０单位／毫克;ｋｏａｔ为９Ｓ－１。ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力对ＡＴＰ和Ａｒｇ的Ｋｍ分别为８．３ｍｍｏｌ／Ｌ和９９μｍｏｌ／Ｌ;Ｖｍａｘ为１６３２０单位／毫克;ｋｃａｔ为１８Ｓ－１。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子,得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量生活为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１,转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇ     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶（ArgRS）及其变种的光谱…

本文用吸收光谱，溶剂微据差光谱，荧光光谱和ＣＤ光谱对天然酶ＡｒｇＲＳ及其变种酶ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ，ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ和ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的构象进行了研究。结果表明Ｌｙｓ３０６的突变引起变种酶分子表面的生色氨基酸残然的处微环境与天然酶稍有不同，ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ比ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ有更大的构象变化。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys378和381的点突变研究

用点突变的方法将大肠杆菌精氨酰—ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因ａｒｇｓ上相应于Ｌｙｓ３７８和Ｌｙｓ３８１的密码ＡＡＡ分别变为两氨酸的密码ＧＣＡ和精氨酸的密码子ＣＧＴ,得到了４个ａｒｇｓ的突变体ａｒｇｓ３７８ＫＡ,ａｒｇｓ３７８ＫＲ,ａｒｇｓ３８１ＫＡ和ａｒｇｓ３８１ＫＲ,将它们分别连接到ｐＵＣ１８上,转入大肠杆菌ＴＧ１,在ＴＧ１转化子中,ＡｒｇＲＳ及其变种的表达量约为ＴＧ１中的１２０倍以上。结果表明Ｌｙｓ３７８为Ａｒｇ和Ａｌａ取代分别使活力下降０％和１０％;Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ和Ａｒｇ后,活力分别下降３３％和１０％左右。Ｌｙｓ３７８不为酶活力必需。Ｌｙｓ３８１部位的正电荷对酶活力是重要的。     

缺失Arg245和252对大肠杆菌ArgRS的影响

为研究大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的结构与功能的关系,用基因突变法将２４５和２５２位的两个Ａｒｇ分别缺失,得到了突变基因ａｒｇＳΔｒ２５２。对ａｒｇＳΔｒ２４５的表达和变种酶的性质进行了研究,野生型基因在大肠杆菌中以可溶性蛋白的形式表达,而缺失了Ａｒｇ２４５的突变酶ＡｒｇＲＳΔＲ２４５在大肠杆菌中形成了包涵体蛋白。包涵体蛋白复性后,酶的比活约为４０单位／毫克,为天然     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度

用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体（Ｎ１８４Ｄ和Ａ１９８Ｃ）。含突变体的重组质粒ｐＴＫＤ－ＧＩ１（Ｎ１８４Ｄ）和ｐＴＫＤ－ＧＩ２（Ａ１９８ｃ）在Ｅ．ｃｏｌｉＫ３８菌株中表达,用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ＨＲ柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明：（１）突变酶Ｎ１８４Ｄ的最适ｐＨ值下降了１个单位;等电点下降了０．６个单位     

编码大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的基因（argS）拥？…

编码大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因（ａｒｇＳ）和编码亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）的基因（ＬｅｕＳ）分别插入ｐＵＣ１８后,各自在Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中的表达有很大的差异（高表达倍数分别为１０００和３５倍）。为了调查造成其表达差异的原因,用ａｒｇＳ的５＇上游非编码区取代ｌｅｕＳ的５＇上游非编码区,构建了融合基因ｐａｒｇ－ｌｅｕＳ;将它插入质粒ｐＵＣ１８     

利用突变的绿化荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体

将三位点替换突变的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ）基因插入到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）的ＸｂａⅠ和ＳａｃⅠ之间,构建为新型的克隆载体ｐＧｒｅｅｎＬＤ。此质粒载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达后使菌落在日光下呈现黄绿色,而在长波紫外光照射下呈现亮绿荧光,当外源ＤＮＡ片段插入该载体的多克隆位点使ｇｆｐ基因表达受阻时,转化的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落为白色。因此可以用Ｅ．ｃｏｌｉ菌落黄绿色／绿色     

利用突变的绿色荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体

将三位点替换突变的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ＿Ｓ６５Ｔ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ）基因插入到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＸｂａⅠ和ＳａｃⅠ之间,构建为新型的克隆载体ｐＧｒｅｅｎＬＤ。此质粒载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达后使菌落在日光下呈现黄绿色,而在长波紫外光照射下呈现亮绿荧光,当外源ＤＮＡ片段插入该载体的多克隆位点使ｇｆｐ基因表达受阻时,转化的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落为白色。因此可以用Ｅ．ｃｏｌｉ菌落黄绿色／绿色荧光的消失作为检测指标来筛选含有重组质粒的克隆。     

云南山茶属茶组一新变种

云南山茶属茶组一新变种张芳赐（云南农业大学,昆明６５０２０１）ＡＮＥＷＶＡＲＩＥＴＹＯＦＴＨＥＧＥＮＵＳＣＡＭＥＬＬＩＡＳＥＣＴ．ＴＨＥＡＦＲＯＭＹＵＮＮＡＮＺｈａｎｇＦａｎｇｃｉ（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＹｕｎｎａｎ,Ｋｕｎ...     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

分泌型重组人生长激素的研制

从人脑垂体组织中克隆了人生长激素基因并构建了分泌型表达基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ８０２／ｐＡＶＧＨ。研制的ｒｈＧＨ中试产品,各项技术指标均达到临床应用要求     

SELF-TRAINING NEURAL NETWORK MODEL FOR REAL TIME TOMOGRAPHY DATA PROCESSING

ＳＥＬＦ—ＴＲＡＩＮＩＮＧＮＥＵＲＡＬＮＥＴＷＯＲＫＭＯＤＥＬＦＯＲＲＥＡＬＴＩＭＥＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹＤＡＴＡＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧＹｕ．Ｋｕｌｃｈｉｎ;Ｏ．Ｋａｍｅｎｅｙ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆｐｈｙｓｉｃｓ,ＦａｒＥａｓｔｅｒｎＳｔａｔｅＴｅｃ...