酵母PH081在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌产β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸醋酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,揭示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１在酸性磷酸酯酶基因表达系统中是一个中介因子。在此基础提出了一个酸性磷酸酯酶基因调控的分子模型。     

酵母PHO80基因的克隆,表达及功能分析

利用原位杂交方法从野生型酵母菌染色体ＤＮＡ中克隆了ＰＨＯ８０基因,全长约４．２ｋｂ,包括１．１ｋｂ的上游序列和８７９ｂｐ的编码序列。以ＵＲＡ３基因为筛选标记,通过体内同源重组和营养互补筛选获得了ＰＨＯ８０基因缺失突变株。进一步研究了ＰＨＯ８０在细胞内的功能,它是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶结构基因以及调控基因ＰＨＯ８１表达的负调控因子,但不影响ＰＨＯ４和ＰＨＯ８５的表达。还构建了ＰＨＯ８０－ＬａｃＺ融合基因,探索它在细胞内的表达规律。β－半乳糖苷酶活力测定结果表明,ＰＨＯ８０基因在细胞内呈低水平表达,并受自身产物和ＰＨＯ８５的抑制,推测它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ８１基因的调控模式可能相似。     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

酵母酸性磷酸酯酶基因表达与细胞周期活动

酵母酸性磷酸酯酶基因表达与细胞周期活动敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所上海２０００３１）酵母酸性磷酸酯酶基因家族是一个复杂的系统,其中包括４个结构基因：ＰＨＯ３、ＰＨＯＳ、ＰＨＯ１０和ＰＨＯｌｌ,分别编码不同的酸性磷酸酯酸。ＰＨＯ５、ＰＨＯ１０和...     

酵母酸性磷酸酶基因表达的分子机制

酵母酸性磷酸酶基因表达的分子机制敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,上海２０００３１）酵母酸性磷酸酶ＰＨＯ５基因是一种阻遏型基因,它的表达受高浓度无机磷的阻遏,在低浓度无机磷条件下去阻遏［１］。ＰＨＯ５基因的转录至少受５种蛋...     

酵母PHO85基因的定点诱变和功能分析

克隆酵母ＰＨＯ８５基因，用ＵＲＡ３基因取代其部分编码序列，通过染色体同源重组的途径，构建ＰＨＯ８５缺失突变株。以细胞内酸性磷酸酯酶的活力水平显示ＰＨＯ８５的功能作用。完整ＰＨＯ８５基因转入缺陷型酵母菌，能使表达回复，位点专一诱变的ＰＨＯ８５基因（Ｇｌｙ１３→ＡＳＰ或ＬＹＳ３３→Ｇｌｕ）丧失此种功能。ＰＨＯ８５与ＣＤＣ２８编码的蛋白激酶有较高的同源性。ＰＨＯ８５的Ｇｌｙ１３和Ｌｙｓ３３相当于蛋白激酶     

酵母PHO2蛋白及其变异体与PHO5USA体外的相互作用

酵母ＰＨＯ２蛋白及其变异体与ＰＨＯ５ＵＳＡ体外的相互作用杨军,敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词酵母;ＰＨＯ２;突变;ＤＮＡ结合ＰＨＯ２是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶基因转录的正调控因子［１］,由５５９个氨基...     

酵母PHO85结合蛋白PAP1基因的克隆和表达

酵母调探因了ＰＨＯ８５是一个依赖于细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）的蛋白酶（ＣＤＫ）,参与对细胞周期和酸性磷酸酯酶基因表达的调控。冯ＰＨＯ８５为靶分子,利用酵母的染色体基因文库中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,利用酵母双杂交（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）系统从酵母的染色体基因文加中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,将此蛋白质命名为ＰＡＰ１（ＰＨＯ８５ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ     

酵母转录因子PHO2在PHO5,HIS4及HO基因表达中的作用

酵母ＰＨＯ２蛋白在多个不同基因的表达中起作用,是一个多效的转录激活因子。本文比较了该因子要ＰＨＯ５,ＨＩＳ４及ＨＯ３种基因表达系统中的作用。ＰＨＯ２的缺失使ＰＨＯ５在低磷时不能去阻遏;使ＨＩＳ４和ＨＯ的表达分别降低到正常的２５％和４０％。如果把克隆于抵拷贝穿梭质粒的ＰＨＯ２基因转入ＰＨＯ２缺陷的酵母菌,则３种基因的表达都恢复正常。     

酵母PHO2与PHO4蛋白的激活活性的分析及两者的相互作用

ＰＨＯ２与ＰＨＯ４是酵母ＰＨＯ５基因的两个正调控因子,本文发现,ＰＨＯ２与酵母转录因子ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合功能域融合后就能激活报道基因ｌａｃＺ的表达,其激活力受高低磷影响,表明ＰＨＯ２蛋白上存在酸性转录激活区。ＰＨＯ２蛋白上酸性氨基酸丰富的２８７－３２６肽段并非ＰＨＯ２的激活区。在ＰＨＯ２蛋白上２３０位Ｓｅｒ处于磷酸化状态２ＰＨＯ２才有激活作用,表明了这一磷酸化位点可能与ＰＨＯ２的转录激活能力有关     

酵母转录调控因子PH081的结构与功能

本文发现ＰＨＯ８１蛋白上的碱性区（８８－１６０）和酸性区（７７１－８１０）附近的微小变化可导致ｒＡＰａｓｅ的表达向组成型转化,且这两个区域是协同作用的,而酸性区的净负电荷的降低能使ｒＡＰａｓｅ的活力降低。ＰＨＯ８１蛋白中有６个锚蛋白重复单位（ａｎｋｙｒｉｎｒｅｐｅａｔｓ）,是ＰＨＯ８１蛋白与ＰＨＯ８０－ＰＨＯ８５蛋白复合物的结合区。对锚蛋白重复序列的突变表明锚蛋白重复序序列１,２,４,５,６对ＰＨＯ８１是十分关键的,而锚蛋白重复序列３的Ｐｒｏ５０９,Ｌｅｕ５１０的缺失并不影响ＰＨＯ８１的功能。在ＰＨＯ８１蛋白的７０１－７１９位氨基酸残基有一段类似核定位序列的肽段,相应基因片段的缺失导致ＰＨ０８１完全失活。但将该可能的核定位序列的最保守的碱性氨基酸Ａｒｇ７０１、Ｌｙｓ７０２同时变为中性氨基酸（Ｓｅｒ,Ｇｉｎ）导致ｒＡＰａｓｅ的表达大大提高,而将核定位序列中Ｌｙｓ７１７变为Ａｓｎ,或将Ａｒｇ７１９变为Ｓｅｒ,都不影响ＰＨＯ８１的功能。     

酵母PHO4基因的克隆与表达

用原位杂交方法从酵母菌染色体ＤＮＡ中分段克隆,拼接,获得完整的ＰＨＯ４基因,全长约３．４ｋｂ,利用体内同源重组的方法,构建了ＰＨＯ４基因缺失突变株。ＰＨＯ４基因的缺失导致酸性磷酸酯酶活性明显下降,将完整的ＰＨＯ４基因转入这种缺陷细胞,能使酶活性回复到野生型水平,ＰＨＯ４起正调控作用,构建ＰＨＯ４－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ４的表达水平。融合基因不同名的表达表明,ＰＨＯ４基因     

酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

酵母PH081基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷敏的     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对PHO4的磷酸化

酵母ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＡＰ１与其它的ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＨＯ８０、ＰＣＬ１及ＰＣＬ２有较高的同源性。我们上ＰＡＰ１与ＨＡ抗原的融合基因,利用抗－ＨＡ抗体进行免疫沉淀。体外翻译的融合ＨＡ标记肽的ＰＡＰ１与体外翻译的ＰＨＯ８５的免疫共沉淀证明了ＰＡＰ１与ＰＨＯ８５的结合。同时纯化了大肠杆菌表达的ＰＨＯ４蛋白,并构建了Ｐ９ＨＯ８５：：ＰＲＰ１缺失株。ＰＡＰ１与ＨＡ的融合基因被置于酵母ＡＤＨ１启动子的控     

PHO4和PHO2蛋白与PHO81基因调控序列的相互作用

高效表达产纯化了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白,凝胶阻抑电泳分析证明了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白与ＰＨＯ８１上游－４０１－２８９ｂｐ片段的结合,定点突变ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸为天冬氨呈丙氨酸,不影响ＰＨＯ２蛋白与此片段的结合。足迹法分析证明了ＰＨＯ４结合在ＰＨＯ８１基因上游的３５４－３３３ｂｐ,ＰＨＯ２结合在３４１－３３４ｂｐ。因此,这些结果表明－４０１－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,     

酵母转录因子PHO81锚蛋白重复序列表达和功能分析

酵母转录因子ＰＨＯ８１蛋白含有６个锚蛋白重复序列。将ＰＨＯ８１锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达（ＧＳＴ－ＡＮＫ）,表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了ＰＨＯ８５－ＰＨＯ８０和ＰＨＯ８５－ＰＡＰ１激酶复合物,用重组的ＰＨＯ４蛋白作底物,在激酶反应体系中加入ＧＳＴ－ＡＮＫ,发现它     

酵母PHO81蛋白的结构预测和功能分析

以Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ和ＧＯＲ方法预测酵母ＰＨＯ８１蛋白的二级结构。用Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ方法分析它的疏水性。分析了ＰＨＯ８１蛋白与其他蛋白的同源性,发现它包含５个ＳＷ１６／ＡＮＫ重复单位,这些重复单位可能是ＰＨＯ８１蛋白与负调控因子ＰＨＯ８０相互作用的位点。     

PHO80、PHO85基因和芽殖酵母金属离子耐受

PHO8 5基因是芽殖酵母中的一个多功能基因。它参与了无机磷酸的代谢、碳源利用、糖原积累、特定蛋白质的降解和细胞周期调控。研究了酵母株YPH499及其衍生的pho85缺失株、pho80缺失株、pap1(pcl7)缺失株在不同浓度的不同金属离子中的存活情况 ,结果表明和芽殖酵母YPH499相比 ,pho85缺失株和pho80缺失株表现出对K 、Mg2 、Zn2 、Ca2 和Mn2 的耐受下降 ,而PAP1基因的缺失则不会导致芽殖酵母对上述金属离子的敏感性的变化 ;而对Cu2 ,3株突变株都表现出和YPH499相同的耐受性。同时测定了各缺失株和YPH499对上述金属离子的半致死浓度以及pho85缺失株、pho80缺失株和YPH499的细胞内总钙量。这些结果显示 ,PHO85蛋白激酶通过和它的PCLPHO80而不是PAP1结合 ,参与了芽殖酵母K 、Mg2 、Zn2 、Ca2 和Mn2 离子平衡的调控。PHO85和PHO80基因的缺失损害了芽殖酵母钙的储存。     

酵母Pho80对Pho85蛋白激酶活性的调节

酵母pho80和pho85基因编码的蛋白质是阻遏型酸性磷酸酯酶基因表达调控系统中的2种负调控因子.其中pho85基因编码产物己被证明是1种类似于p34~(^cdc2/CDC28)的蛋白激酶,磷酸化该调控系统中的正调控因子Pho4,并使之失活,用抗pho85抗体从啤酒酵母YPH499及其衍生菌株的细胞抽提液中得到Pho85免疫复合物,对大肠杆菌表达的Pho4蛋白进行了体外磷酸化分析,证实酵母Pho80是Pho85蛋白激酶活力所必需,pho80基因的表达水平直接影响Pho85免疫复合物对Pho4蛋白的磷酸化程度.根据基因序列推导的Pho80蛋白氨基酸序列中,含有一段与几种cyclin同源的区域,通过寡核苷酸的插入或小片段缺失而对该区域及邻近部位在基因水平进行的微小改变均可导致Pho80丧失阻遏酸性磷酸酯酶基因表达的能力.