人细胞周期相关激酶启动子的克隆和初步分析

克隆人的细胞周期相关激酶(CCRK)基因启动子,分析与其表达有关的转录调控因子。通过巢式PCR方法,从人的基因组总DNA中分离出CCRK基因5′端非翻译区大小为1072bp的片段。这段片段的3′端起始点在第一个外显子里第一个翻译密码子ATG( 1)上游128bp处。以1072bp为模板,对启动子进行5′端删除分析,分别扩增951bp(-1072／-128)、564bp(-692／-128)、313bp(-441／-128)、127bp(-239／-128)的片段,与pGL3-Basic荧光素酶报告载体重组构建,人工加上克隆位点,5′端带有KpnI、3′端带有XhoI位点。瞬时转染恶性神经胶质瘤细胞株U373,通过双荧光素酶活性进行分析。对分离出的1072bp的片段进行测序,结果与GenBank(Accession AF035013)的序列比较,同源序列达到98％。双荧光素酶活性分析564bp片段有最强的活性,313bp片段为有活性的最小片段。本研究为进一步研究分析CCRK的核心启动子和与其相关的转录因子奠定基础。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与基因结构以及5′端启动子活性的分析

人类锌指蛋白ZNF191为类krueppel转录因子,其可能与神经精神病、心血管疾病和肝癌等疾病的发生或发展有关,为了采用基因敲除模型来探讨它的生理功能,克隆和定位其在模式生物（小鼠）中的同源基因,并阐明其结构特征是必需的。通过筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,获得了它在小鼠中的同源基因ZF－12基因组全长片段。序列分析表明：该基因含有4个外显子和3个内含子,内含子都遵循GT／AG的剪接模式;第91密码子处存在单核苷酸多态性;可能存在2种大小不同的3′端的非翻译区（3′－UTR）;与锌指蛋白基因Zfp-35相连锁,可将其定位于18号染色体的B3－C带上或附近;5′端上游存在1个约250bp高度富含GC的启动子序列。ZF－12基因的5′端系列缺失荧光素酶基因报告载体的瞬时转染实验表明:其上游序列（-762～ 70bp）具有启动子转录活性,在更上游的序列（－824～-762bp)上可能存在负调控元件。这项研究结果为进一步的基因敲除研究奠定了基础。     

大口黑鲈脂代谢相关基因NPY、UCP2、LPL、HL克隆与分子进化分析

采用RT-PCR和RACE方法克隆了大口黑鲈NPY基因cDNA全序列及UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段。序列分析结果表明,大口黑鲈NPY基因cDNA全序列长664 bp,其中5′端非翻译区(5′-UTR)长53 bp,3′端非翻译区(3′-UTR)长311 bp,开放阅读框(ORF)长300 bp,编码99个氨基酸,即前体NPY。大口黑鲈前体NPY包括三个部分,28个氨基酸组成的信号肽、36氨基酸组成的成熟NPY以及32个氨基酸组成的由Gly-Lys-Arg指示的NPY C端肽（CPON）。大口黑鲈UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段长度分别为737 bp、509 bp和666 bp,各自编码245个氨基酸、169个氨基酸和222个氨基酸。将4个基因的氨基酸序列分别与其他物种的氨基酸序列进行同源性比较,并通过MEGA3构建系统树,对这4个脂代谢相关基因的分子进化特征进行了探讨。     

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因5′旁侧区近端1.2kb和远端1.6kb的片段。通过拼接,构建出含有2505bp启动子区和转录起始位点下游86bp的共2591bp的基因5′旁侧区片段;其启发性动子区中34至28为推测的TATA盒序列,158至146为推测的CCAAT盒,与其它植物基因启动子结构相类似。将2.5kb启动子片段与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达,从功能上证明了此25kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建5个含不同5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至-1111的启动子区中,而在-1111至-608区间可能存在一个正控制区。     

牛α—s1酪蛋白基因5’端及上游区的克隆鉴定和部分序列分析

本文以PcR法克隆得到牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段,并以该片段为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库,得到一个阳性克隆。酶切该克隆,并以牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段及该基因cDNA为探针杂交,鉴定了该插人片段的方向,亚克隆了各相应酶切片段,制作了较为详细的限制酶图谱,并分析了该基因转录起始点前后部分序列。与该基因现有的资料比较,酶切图谱存在部分位点的差异,序列存在少量突变和缺失,在5’上游区均发现有内含子及外显子部分,且缺失均发生于有重复序列的部位。     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

糜子抗旱节水相关基因PmMYB的克隆及表达分析

根据在糜子抗旱节水分子基础研究中获得的一个糜子MYB基因的EST序列, 以其序列及水稻MYB18基因的序列为基础设计引物, 扩增得到1 739 bp的全长基因组序列。序列分析表明, 其包含121 bp(347~467 bp)和93 bp(599~691 bp)的两个内含子, 3个外显子; 全长cDNA序列为1 525 bp, 其中3′非翻译区为212 bp, 5′非翻译区为41 bp, 编码区为1 272 bp, 共编码424个氨基酸, C-端存在一个丝氨酸(Ser, S)丰富区。该基因具有两个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区(DNA-binding domain), 分别为13~63、66~114位氨基酸, 属于典型的R2R3-MYB转录因子。对其与水稻、玉米、火炬松、拟南芥、辣椒、陆地棉、大麦及茄子等9种植物的MYB基因的R2、R3重复区的氨基酸序列多重比较, 表明R2R3重复序列在植物中具有较高的保守性; 基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明, 不同植物的MYB基因遗传分化很大, 序列相似性为32%~84%, 其中糜子MYB基因与水稻的MYB18相似程度最高(84%), 与大麦和玉米的相似性分别为46%和41%。通过半定量RT-PCR对其表达模式分析表明, 该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达, 与糜子抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。     

胞质雄性不育白菜叶绿体ndhJ-trnF区域序列发生变异

以来自Polima胞质甘蓝型油菜雄性不育源转育获得的不育白菜‘Bpol97-05A’和其回交亲本即保持系‘Bajh97-01B’为材料，利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)技术获得一条长约330 bp的特异片段P1708，RT-PCR验证确认该序列为不育白菜材料所特有，经测序和BLAST比对，发现该片段除54 bp的插入序列外，其余部分与大白菜和甘蓝叶绿体ndhJ-trnF基因之间的一段序列完全一致. 根据基因区域两端的保守部位设计引物，以Polima不育白菜DNA和可育甘蓝型油菜的DNA为模板，分别获得了长约1 900 bp的序列，比较序列发现：不育白菜与可育白菜、甘蓝型油菜的DNA序列存在一定差异，‘Bpol97-05A’中除多个位点发生变异外，另有108 bp的插入序列，该插入由2个长度为54 bp的重复序列组成，重复序列中除5′端3个碱基CTT外，其余部分均与trnF基因3′端51 bp完全相同.     

牛催乳素基因组及其cDNA全长序列的分子克隆和分析

通过LongPCR等技术首次克隆得到全长9388bp的牛催乳素（bPRL)基因组序列（GenBank登录号AF426315）,其中包括bPRL基因全部5个外显子和4个内含子,5′端854bp的上游调控区以及3′端69bp的UTR,AF426315基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAL28075,由229个氨基酸残基组成,1-30位氨基酸残基为信号肽序列,成熟的多肽含有199个氨基酸残基,将bPRL基因组DNA真核表达载体转染COS-7细胞后通过RT-PCR得到长度为804bp的bPRLcDNA序列,该序列涵盖了bPRL基因的全部ORF区,证明本研究所获得的bPRL基因组DNA具有转录的生物学功能,Blast搜索结果显示,GenBank数据库中收集有多条bPRL基因的mRNA和EST序列,各序列间存在多个SNP位点,主要分布于下游编码区和3′端的UTR,这些位点均未改变相应的氨基酸残基的性质,此外,5′端编码信号肽序列的区域呈现高度保守性。     

22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析*

利用RT PCR方法获得了 1 3株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的扩增片段 ,并对其进行了测序 ,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析 ,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较 ,结果 1 3株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列 ,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列 ,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的 3′端。     

Cloning of a cDNA encoding an ETR2-like protein (Os-ERL1) from deep water rice (Oryza sativa L.) and increase in its mRNA level by submergence, ethylene, and gibberellin treatments

A cDNA from deep water rice treated with ethylene, encoding an ethylene receptor homologous to Arabidopsis thaliana ETR2 and EIN4, was isolated using differential display and RACE techniques. The cDNA (2880 bp), corresponding to the Os-ERL1 gene (Oryza sativa ETHYLENE RESPONSE 2 like 1; GenBank accession number AB107219), contained an open reading frame of 2289 bp coding for 763 amino acids. The protein Os-ERL1 has 50% and 52% similarity to Arabidopsis ETR2 and EIN4, respectively. The Os-ERL1 gene was up-regulated by flooding, and by treatment with ethylene and gibberellin. These results suggest that deep water rice responds to flooding by increasing the number of its ethylene receptors.     

甜瓜乙烯信号转导途径关键因子基因CTR1的克隆及表达特性分析

在拟南芥中,CTR1在乙烯信号转导途径中发挥重要的负调控作用.目前的研究表明,在拟南芥中只存在一个CTR1基因.利用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到CTR1基因cDNA(Cm-CTR1).Cm-CTR1cDNA全长2 613 bp,编码870个氨基酸.氨基酸序列比对和同源性分析表明,所克隆的甜瓜CTR1基因与拟南芥CTR1基因相似度为53.69％.Cm-CTR1的C-末端具有明显的类似于哺乳动物和果蝇中的Raf( retro-viral protein,V-raf)蛋白激酶家族的丝/苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)的特征.该结构具有所有已知蛋白激酶所共有的11个亚结构域,其中包括ATP结合位点和丝/苏氨酸蛋白激酶位点结构域,说明CmCTR1与其他植物CTR1相似.实时荧光定量PCR分析结果表明,从授粉后第15天到第20天,甜瓜果实Cm-CTR1基因表达量显著增加,第20天的表达量是第15天的2.5倍,之后表达水平趋于稳定,第40天到第45天表达量有所下降.     

大白菜BrMYB34-3基因的3′-RACE克隆及表达

以大白菜叶片为材料,根据NCBI数据库中Br MYB34-3基因序列的已知信息,利用3-RACE获得了Br MYB34-3基因全长,用RT-PCR方法对Br MYB34-3在不同组织中的表达进行分析.结果显示,该基因全长1 135 bp,编码280个氨基酸.Br MYB34-3具有R2R3-MYB(含有2个MYB结构域的转录因子)典型的R2、R3结构域及基序.其氨基酸序列与大白菜的Br MYB34-1和Br MYB34-2、拟南芥的At MYB34具有较高的一致性.Br MYB34-3在莲座叶、当天开的花中表达水平较高,在花序顶端表达水平较低,在根和花序轴中未检测到表达,这与拟南芥At MYB34的表达模式不同.研究表明,Br MYB34-3是大白菜中的MYB34同源基因,在功能上可能与拟南芥At MYB34基因存在差异.     

油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。