东亚钳蝎中一个中性哺乳动物神经毒素全长cDNA的克隆和分析

构建了东亚钳蝎毒腺cDNA文库,根据东亚钳蝎中性哺乳动物神经毒素BmKM4的氨基酸序列设计并合成引物,用PCR方法从文库中筛选到BmKM4全长cDNA序列.它由5′UTR、可读框和3′UTR组成.与其他东亚钳蝎哺乳动物神经毒素cDNA的相应区域相比,BmKM4cDNA的5′UTR高度保守,而其3′UTR则变异较大.AUG的旁侧序列为AAAATGAA,与绝大多数蝎毒素基因一致.在BmKM4mRNApoly(A)尾上游17nt处,有一典型的腺苷化信号(AATAAA).可读框编码84个氨基酸的毒素前体,包括N端19个氨基酸残基组成的信号肽,中间64个氨基酸残基组成的成熟毒素,以及C末端的额外碱性氨基酸Arg.椐据一般规律,尾端Arg在毒素前体的成熟过程中会被切除。Abstract:A full-length cDNA sequence encoding the precursor of a neutral mammalian neurotoxin,BmKM4,was first isolated from a cDNA library made from thc venom gland of Chinese scorpion Buthus martensii Karsch.ABmKM4-specific primer and a primer corresponding to the partial sequence of pSPORT1 vector were used as forward primer and reverse primer,respectively,to screen the cDNA library by PCR reaction.Sequence analysis of positive clones showed that the BmKM4 cDNA is composed of three parts:5'UTR,open reading frame and 3'UTR.Compared with the corresponding regions of other scorpion mammalian neurotoxin cDNAs,the 5'UTR of BmKM4 cDNA is highly conservative versus highly variable for 3'UTR.The lateral sequence of initiation codon (AUG) is AAATGAA which is in consistent with that of most scorpion toxin genes.On the 3'-end,a putative polyadenylation signal (AATAAA) was 1Tnt upstream of Poly (A) tail.The open reading frame encodes a precursor of 84 amino acid residues,including a signal peptide of 19 residues,a mature toxin(BmKM4) of 64 residues,and a basic residue (Arg) tailwhich would be removed in the processing step.     

两个东亚钳蝎抗哺乳动物神经毒素的cDNA序列

从我国山东东亚马氏钳蝎尾腺中分离纯化ｍＲＮＡ,经逆转录构建了ＢｍＫ蝎毒ｃＤＮＡ文库。利用ＰＣＲ扩增,筛选到两个抗哺乳动物毒素的ｃＤＮＡ基因,并测定了序列。这两个ｃＤＮＡ阅读框均为２５２ｂｐ组成,可翻译８４肽的毒素前体,包括Ｎ端１９个氨基酸组成的信号肽,６４个氨基酸残芭的成熟毒蛋白,以及Ｃ端一个额外的碱性氨基酸Ａｒｇ。其中由一ＣＤＮＡ所推导的氨基酸序列（ＢｍＫＭ１）一已知的天然毒素ＢｍＫ１蛋白序列完     

一个新的东亚钳蝎毒素(BmKT_1)全长cDNA的克隆和分析

首先构建了东亚钳蝎毒腺组织 c DNA文库 ;根据已知的东亚钳蝎哺乳动物毒素氨基酸序列保守区设计引物 ,并用 PCR从 c DNA文库中扩增出一个 c DNA片段作为筛选 c DNA文库的探针 ;从 c DNA文库中筛选到二个编码同一个新的蝎毒素多肽的 c DNA,它们除 3′- UTR外 ,其余序列完全一致 .它们均含有 2 55bp长的开放阅读框 ,编码 85肽的前体毒素 ,包括 1 9个氨基酸残基的信号肽 ,66个残基的成熟毒素 (命名为 Bm KT1) ;Bm KT1氨基酸序列与已知的蝎毒素具有较大的同源性 ,与 Bm KM1,Lqq ,Lqhα IT和 Bm K M10 的同源性分别为 77%、67%、67%和 65% .Bm KT1的 C端不存在末端修饰步骤且具有一个与这些毒素不相同的特征结构 ,即在末端延伸了两个氨基酸残基 - P- S,推测 Bm KT1具有新的活性功能特征 .     

两步PCR快速扩增东亚钳蝎BmKIT3 3′cDNA末端序列

对3′-RACE方法进行了修改,采用一条特异性引物和一条通用Oligo dT引物成功地克隆了东亚钳蝎BmKIT3 3′cDNA末端,与常规3′-RACE方法相比,两步PCR方法具有节约成本、节省时间、增加反应特异性等优点,尤其适用于生物活性肽基因的快速克隆和鉴定.     

一种东亚钳蝎碱性神经毒素的纯化和初步晶体学研究

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５两次柱层析,从河南淅川马氏钳蝎毒素中分得一种碱性神经毒素ＢｍＫＭＩ８。等电聚聚焦和ＳＤＳ电泳显示单一组分,其ＰＩ为９．１,Ｍｒ为７１００,毒性测试结果表明,该组分对小白鼠有较强的毒性,对昆虫也有一定的毒性。已获得该毒素的两种晶全型的大单晶,并测定其空间群为Ｐ２１２１２１,晶胞参数为：ＢｍＫＭＩ８－Ａ：ａ＝３６．７Ａ,ｂ＝２６．６Ａ,ｃ＝５２     

基因组研究中全长cDNA克隆的策略

全长ｃＤＮＡ的克隆是上前人类基因组研究中的一个重要方面,与大规模基因组测序相比较,ｃＤＮＡ测序克隆用相对较少费用获得更多的功能基因信息,故也是符合我国国情的基因组研究的主要方向。如何更加高交地获得新的全长ｃＤＮＡ,本文结合作者工作中的经验,对从全长文库的建立到全长ｃＤＮＡ的测序及克隆方法作了较为详细的介绍。     

东亚钳蝎毒液透明质酸酶全基因序列的克隆和结构分析

本研究通过以东亚钳蝎毒腺为研究材料,采用TRIzol法分离透明质酸酶的全基因序列,并从中分离出4个东亚钳蝎透明质酸酶序列,分别命名为BmHYⅠ、BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHYⅣ。BmHYⅠcDNA全长是1423 bp,包括42 bp的5’非翻译区,1230 bp的开放阅读框,编码了一个410个氨基酸,还有151 bp的3’非翻译区;BmHYⅠ中包含5个糖基化位点;与其它物种蛋白质比对结果显示,BmHYⅠ中有10个高度保守半胱氨酸残基形成5个二硫键。BmHYⅠ在二级结构中形成了13个螺旋和14个折叠,其中折叠主要分布在N端和C端。系统进化树结构表明,东亚钳蝎BmHYⅠ与其它蝎子物种透明质酸酶亲缘关系最近,其次是蜘蛛,最后是脊椎动物。而BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHYⅣ序列缺少终止密码子,蛋白序列与BmHYⅠ具有高度同源性。本研究结果为进一步透明质酸酶的功能提供数据参考。     

东亚钳蝎神经毒素基因BmK IT3的克隆及其在大肠杆菌中的表达

东亚钳蝎毒素基因ＢｍＫＩＴ3 编码是由 6 5个氨基酸残基组成的多肽物质。该类毒素为专一性作用于昆虫的抑制型神经毒素 ,它已被广泛用于研究离子通道作用机理[1 ] ;同时 ,它是研究蛋白质结构和功能的极好模型 ,是研究神经药理学的理想工具 ,将具有药理活性和昆虫毒性的基因导入细胞或动植物体内具有十分重要的应用价值。它对昆虫作用的专一性很高 ,对哺乳动物无害或毒性很小 ,可作为一种安全、有效的生物杀虫剂[2 ,3 ] 。我们的研究是对该基因密码子进行优化 ,采用化学合成的方法合成了适于在昆虫中表达的ＢｍＫＩＴ3 的两条长的引物 ,通过…     

具有中等毒性的马氏钳蝎神经毒素的纯化和初步晶体学研究

运用柱层析技术对产自淅川和常德的马氏钳蝎毒素进行分离纯化,得到８种哺乳动物神经毒素。运用制备型等电聚焦电泳技术,对常德样品中具有中等毒性的蝎神经毒素（ＢｍＫ５）进一步纯化,获得了高纯度样品。两个产地的蝎毒素ＢｍＫ５均已经成功地获得了大晶体。空间群均为Ｐ２１２１２１,晶胞参数分别为：ａ＝３８．４６埃,ｂ＝３７．２８埃,ｃ＝３６．９７埃（淅川）;ａ＝３８．４４埃,ｂ＝３７．５５埃,ｃ＝３６．８３埃（常德）。对两个产地的晶体分别收集了２．１埃（淅川）和１．６２埃（常德）分辨率的衍射数据。     

中华眼镜蛇神经毒素cDNA的克隆及表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法,从广西产中华眼镜蛇总ＲＮＡ中克隆到３个新的神经毒素ｃＤＮＡ序列,命名为ＮＬ１、ＮＬ２和ＮＬ３。它们编码的蛋白质序列与台湾眼镜蛇神经毒素ｃｏｂｒｏｔｏｘｉｎ的同源性分别为７７％、７２％和９８％,均具有维持ｃｏｂｒｏｔｏｘｉｎ结构与功能必需的残基Ｔｙｒ＾２５、Ｌｙｓ＾２７、Ｔｒｐ＾２９、Ａｒｇ＾３３和Ｌｙｓ＾４７。ＮＬ３克隆于ｐＥＴ２８ｂ＋表达载体内,转化至ＢＬ２１（ＤＥ３）中     

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

为了获得ＨＩＶ辅助受体ＣＸＣＲ４基因,进一步探索艾滋病（ＡＩＤＳ）的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶链式反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人外周血淋巴细胞中克隆了ＣＸＣＲ４　ｃＤＮＡ基因,得到了预期的１　１００ｂｐ左右的片段。将ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接,并进行了酶切反应鉴定,获得与Ｔ载体正向连接的克隆。测序结果表明：克隆的片段含有一个开放性阅读框架,编码３５２个氨基酸残基。搜索ＧｅｎＢａｎｋ,目标片段与Ｍ９９２９３、ＸＭ０５１２２３、ＸＭ０５１２２４、　ＸＭ０５１２２５有很高的同源性,比较结果显示：克隆的片段包括完整的编码序列,含两个碱基的差异。     

中国人白细胞介素-12 cDNA基因的克隆及序列分析与比较

为研究中国人ＩＬ－１２的基因特征,采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人脐带血单核细胞中分别克隆了Ｐ３５、Ｐ４０两亚基ｃＤＮＡ基因,包括完整的前体蛋白编码序列,其中Ｐ３５ ｃＤＮＡ编码２１９个氨基酸的多肽,Ｐ４０ ｃＤＮＡ编码３２８个氨基酸的多肽,与国外序列（ＮＫＳＦ、ＣＬＭＦ）比较结果发现：所克隆序列Ｐ３５同ＮＫＳＦ相比,第４４ａａ密友子由ＧＴＣ（Ｖａｌ）→ＧＴＧ（Ｖａｌ）,但未改     

两个枣树扩展蛋白基因cDNA全序列的克隆及分析

用定向克隆法构建了枣树(Ziziphus jujubaMill.)快速生长初期结果枝的cDNA文库,经过重组质粒的筛选,克隆获得两个扩展蛋白基因cDNA全序列,分别命名为ZjEXP1(GenBank登录号:FJ449891)和ZjEXP2(GenBank登录号:FJ449892)。ZjEXP1全长1 037 bp,包含编码254个氨基酸的完整开放阅读框;ZjEXP2全长905 bp,包含编码251个氨基酸的完整开放阅读框。两个序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有一个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)功能域。两者之间的氨基酸同源性为74.0%。从已知的扩展蛋白基因家族的进化分析表明,ZjEXP1和ZjEXP2由一个祖先进化而来,又分别属于两个不同的分支。     

树鼩CXCR4 cDNA的克隆和序列分析

目的　获得树CXCR4的cDNA序列 ,探讨其是否可以支持HIV_1病毒和细胞的结合。方法　设计相应的引物 ,用RT_PCR ,基因克隆 ,DNA序列分析技术。结果　获得了全长为 10 59bp树CXCR4(tsCXCR4)基因的cDNA。发现其核苷酸序列与人的CXCR4(hCXCR4)基因的cDNA有 92 8%的相似性 ,由此推导出的氨基酸序列有 96 9%相似性。与hCXCR4功能相关的关键位点完全相同 ,tsCXCR4的N端第 7和 12位点为酪氨酸 ,第 14、15和3 2位点为谷氨酸 ,胞外环第 183 ,188为精氨酸 ,第 193、2 62位点以及跨膜区 97位点为天冬氨酸。结论　树的CX CR4很可能会作为HIV_1的辅助受体     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。     

Cloning and sequence analysis of the cDNA encoding a snake neurotoxin precursor

A recombinant plasmid has been constructed containing a sequence of 186 nucleotides encoding a potent neurotoxin found in the venom of the sea-snake Laticauda semifasciata and designated as erabutoxin a. This sequence is flanked, in the upstream region, by a sequence of 60 nucleotides encoding a hydrophobic peptide fragment presumably involved in the secretion process of the neurotoxin. The sequence coding for the toxin ends with a termination codon which is followed by a 3'-untranslated sequence of approximately 240 nucleotides (excluding the poly(A) tract).