人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养Transgelin蛋白的检测

为了建立最佳的人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养方法和初步检测子宫平滑肌细胞中Transgelin蛋白的表达,采用组织块贴壁法和酶消化法进行人妊娠子宫平滑肌原代培养.发现组织贴块培养的细胞呈典型的梭状肌细胞样生长,经过传代纯化,通过免疫细胞化学方法检测平滑肌肌动蛋白(smooth muscle acting,SMA)进行细胞鉴定及检测Trangsgelin(smooth muscle 22 alpha,SM22-α)蛋白,得到SMA、snd2-α荧光免疫细胞化学染色为阳性.结果表明组织贴块法对妊娠子宫平滑肌细胞损伤小,可获得状态良好的纯净的子宫平滑肌细胞,子宫平滑肌细胞中大量表达sm2-α,为进一步研究sm22-α在子宫平滑肌细胞中作用打下基础.     

大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及生物学特性比较

目的培养大鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞,细胞纯化与鉴定,比较生物学特性的差异。方法采用血管环贴壁法培养动脉内皮细胞,组织块贴壁法培养动脉平滑肌细胞,并采用有限稀释法挑选内皮细胞单克隆,免疫细胞荧光鉴定二者的特异性标志,相差显微镜观察二者单个细胞及细胞群体在形态上的差异性,CCK-8试剂盒检测细胞的增殖,比较二者对胰酶消化,粘附,冻存后复苏的情况。结果血管环贴壁法成功培养血管内皮细胞,组织块培养法成功培养出血管平滑肌细胞,内皮细胞能够形成单克隆集落,培养的细胞均表达相应的特异性标志,内皮细胞增殖速度和平滑肌细胞有差异,内皮细胞对胰酶的耐受性较差,内皮细胞粘附所需时间短,对冻存后的耐受性较好。结论组织块贴壁法适合内皮细胞和平滑肌细胞的培养,有限稀释法能够纯化原代培养的内皮细胞,大鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞在细胞形态、增殖、粘附、对胰酶的反应、冻存后复苏均存在差异。     

改良组织块消化法建立大鼠气道平滑肌细胞模型

目的：建立改进大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）的体外培养方法,为相关研究提供实验材料。方法：将组织块连续贴壁进行细胞原代培养,胰酶消化传代培养,差速贴壁进行细胞纯化,形态学及免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定。MTT法检测PDGF-BB诱导的ASMC增殖。结果：成功培养大鼠ASMC,以改良组织块消化法最为理想。第四代平滑肌细胞纯度可达95％以上。相差显微镜下培养细胞呈典型“峰谷状”生长。免疫荧光化学染色显示特异性平滑肌肌动蛋白阳性表达。随着PDGF浓度的升高（2-80ng／ml）,MTT比色A490值呈上升趋势。与对照组相比较,80ng／ml、20ng／ml PDGF—BB组有统计学意义（P〈0．01）。结论：改良组织块消化法可缩短培养周期,在充分利用标本的基础上获得大量气道平滑肌细胞。     

大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、培养周期短及传代次数多的大鼠细小肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）培养方法。方法：在无菌条件下,分离雄性SD大鼠肺细小动脉,剥离外膜和剔除内皮细胞,经胶原酶I消化,培养PASMCs。0.4%台盼蓝染色测定细胞活力;倒置相差显微镜观察;免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,进行平滑肌α-肌动蛋白（α-SMactin）鉴定。结果：形态学观察、免疫细胞化学法及免疫荧光染色法鉴定表明培养细胞为PASMCs;细胞存活率在96.5%以上;原代培养后4～7d即可传代,并且生长特点、细胞形态不易发生改变。结论：采用胶原酶I消化法培养PASMCs,方法简单、酶消化时间易控制、培养周期短、重复性好,培养的原代PASMCs具有数量多和生长迅速的特点。     

小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

目的:建立分离培养小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的方法并检测其生长特性。方法:剥离小鼠主动脉中膜层,分别采用组织块培养法及胶原酶消化法分离培养小鼠主动脉来源的原代VSMC,免疫荧光法检测细胞的纯度和分化状态;3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定小鼠主动脉VSMC传代细胞的生长、增殖特性。结果:组织块培养法培养组织块8d后,细胞从组织块边缘爬出,18 d后细胞汇合度达到80%以上后传代;胶原酶消化法分离培养的细胞生长7 d后,汇合度可达80%,此时进行传代;2种方法获得的细胞进行免疫荧光染色,结果显示细胞传至第3代时纯度在95%以上,传至第8代时分化状态并没有改变;MTT法显示细胞生长3~5 d时处于指数生长期。结论:本研究建立了2种可靠稳定的分离和培养小鼠主动脉VSMC的方法,VSMC纯度高,多次传代后细胞特征稳定。     

组织贴块法建立人气道平滑肌细胞体外培养模型的研究

背景:人气道平滑肌已被证实参与气道重塑,气道平滑肌的重塑已成为慢性呼吸道疾病的主要病理改变之一。人气道平滑肌细胞的培养对慢性呼吸道疾病的研究有重要意义。组织贴块法培养人气道平滑肌细胞是原代培养人气道平滑肌细胞的基本方法之一。目的:采用组织贴块法建立人气道平滑肌体外培养模型。方法:采集人气道组织,用组织贴块法进行人气道平滑肌细胞的原代培养,获得的细胞经形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果:培养的细胞呈典型的"谷峰"状生长,胞浆内特异性的平滑肌肌动蛋白阳性表达,符合平滑肌细胞的形态学特征和生物学特性。结论:组织贴块法易操作,结果可信,并可培养出高纯度活性好的人气道平滑肌细胞,成功建立了体外人气道平滑肌细胞增殖模型,提供了研究慢性呼吸道疾病的细胞培养模型。     

原代小鼠肺微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的建立一种简单高效的小鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法。方法选取2～3周ICR小鼠,剪开胸腹腔,取距离肺边缘约1.5mm组织,剪碎成米粒状,置于含有培养液的离心管中,离心洗涤后种瓶进行原代培养。通过细胞形态学观察、细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞。结果接种24h后,红细胞从贴壁的肺组织块边缘向四周游离;48h后,肺微血管内皮细胞爬出,单个细胞形态为多角形或短梭形,细胞间隙较大,胞核清晰,胞浆丰富;96h后细胞融合,呈典型的单层、铺路石样镶嵌式排列。细胞Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,胞质呈棕红色,表达为阳性,阳性细胞率达98%以上。结论随机组织块法能够成功高效分离培养出原代小鼠肺微血管内皮细胞。     

组织贴块法建立人气道平滑肌细胞体外培养模型的研究

背景：人气道平滑肌已被证实参与气道重塑,气道平滑肌的重塑已成为慢性呼吸道疾病的主要病理改变之一。人气道平滑肌细胞的培养对慢性呼吸道疾病的研究有重要意义。组织贴块法培养人气道平滑肌细胞是原代培养人气道平滑肌细胞的基本方法之一。目的：采用组织贴块法建立人气道平滑肌体外培养模型。方法：采集人气道组织,用组织贴块法进行人气道平滑肌细胞的原代培养,获得的细胞经形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果：培养的细胞呈典型的”谷峰”状生长,胞浆内特异性的平滑肌肌动蛋白阳性表达,符合平滑肌细胞的形态学特征和生物学特性。结论：组织贴块法易操作,结果可信,并可培养出高纯度活性好的人气道平滑肌细胞,成功建立了体外人气道平滑肌细胞增殖模型,提供了研究慢性呼吸道疾病的细胞培养模型。     

小鼠主动脉血管平滑肌原代细胞的分离培养及鉴定

目的:血管平滑肌细胞在人类心血管疾病中具有重要的作用,而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠血管平滑肌材料有限,因此建立一种简单高效的小鼠血管平滑肌原代细胞分离培养方法很重要。方法:分离小鼠主动脉中膜层,胶原酶消化法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光方法检测细胞的纯度和分化状态;分离平滑肌细胞特异的报告小鼠的平滑肌细胞,LacZ染色鉴定。结果:用该方法分离的原代平滑肌细胞生长迅速,3d后即可达5×106个。免疫荧光显示,细胞传至第3代后纯度在98%以上,细胞传至8代分化状态没有改变。LacZ染色鉴定报告小鼠分离的3代平滑肌细胞98%以上显示特异的蓝染。两种实验证明,应用此方法分离原代平滑肌细胞可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:与传统的组织块培养法相比,该方法操作简便、经济,可以获得更多高纯度的血管平滑肌细胞。     

蜗轴螺旋动脉平滑肌的培养及其鉴定

目的:本研究通过联合两种常用的细胞培养方法,建立了一个蜗轴螺旋动脉平滑肌细胞原代培养的模型.方法:分离的蜗轴螺旋动脉的平滑肌来自于豚鼠.切碎血管组织并且将其放入37度的0.1%胰蛋白酶溶液中消化20分钟.消化后,将这些消化后的组织块在35-mm的培养皿中贴壁.运用这种培养方法,混杂的成纤维细胞通过与血管平滑肌细胞不同的贴壁能力,可在传代的时候被去除.在7-10天后,细胞从组织块中长出来.大约3周,细胞可长满培养皿.在第三代培养的血管平滑肌细胞中,纯的并且活性好的细胞可以被活得.经过形态学,免疫荧光化学和电镜对这种方法得到的血管平滑肌细胞进行了鉴别.结果:显示了典型的平滑肌的细胞的特点:形态学的"峰-谷"样的生长形态,免疫荧光化学显示这些细胞表达平滑肌细胞的特异性标志物(α-SM-actin和myosin.结论:通过本文研究方法得到的大量的纯的蜗轴螺旋动脉血管平滑肌细胞是一个很好的研究血管平滑肌细胞在内耳循环紊乱过程生理功能的一个体外模型.除此之外,还可以是一些作用于血管平滑肌药物评价的体外模型.     

单筛过滤法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的 采用单筛过滤法获取脑微血管以培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞。方法 取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、单层细胞筛网过滤、收集网上截留组织、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO₂培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测鉴定所培养的目的细胞。结果 体外培养24 h后,短梭形细胞从脑微血管段周围爬出;48 h后“岛屿状”的细胞团簇形成;96 h后细胞融合,呈典型的单层、“铺路石样”、镶嵌式贴壁生长。第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测显示细胞胞质呈现棕红色,表达为阳性。结论 单筛过滤法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。     

大鼠附睾上皮细胞的原代培养及纯化鉴定

目的建立大鼠附睾上皮细胞原代培养及纯化方法。方法利用酶消化法和组织块法对大鼠附睾上皮细胞进行原代培养,然后用胰酶两步消化法进一步纯化附睾上皮细胞,最后分别利用免疫荧光和免疫组织化学染色对原代培养的细胞及相关蛋白表达情况进行鉴定。结果酶消化法较组织块法得到的附睾上皮细胞纯度高,免疫荧光染色结果证明所得附睾上皮细胞主要是主细胞,免疫组织化学结果证明培养的附睾上皮细胞中有雄激素受体和雌激素受体α的表达。结论利用酶消化法对大鼠附睾上皮细胞进行体外培养,方法简单易行,成功率高。     

人脐静脉血管平滑肌促内皮细胞组织因子表达的体外实验研究

目的研究血管平滑肌细胞对血管内皮细胞组织因子表达的影响并探讨其临床意义.方法用贴块法培养人脐静脉平滑肌细胞;酶消化法培养人脐静脉内皮细胞;用培养平滑肌细胞条件培养液(SMC-CM)刺激培养的内皮细胞,一步凝固法检测内皮细胞组织因子的活性;Northern blot检测内皮细胞组织因子的mRNA表达;并用酶联免疫吸附试验检测SMC-CM中IL-1α、IL-1β、TNF-α和VEGF的含量.结果 SMC-CM使内皮细胞组织因子活性呈剂量依赖性增强,作用6h增至最高,最高增强约38倍;SMC-CM使内皮细胞组织因子mRNA表达显著增强;SMC-CM中的组织因子诱导剂不耐热,且并非IL-1α、IL-1β、TNF-α和VEGF等已知的组织因子诱导剂.结论血管平滑肌细胞能促进血管内皮细胞组织因子的表达,提示体内增生的平滑肌细胞,如动脉再狭窄新内膜中的平滑肌细胞可能诱导局部血管内皮细胞活化及表达组织因子,在局部血栓形成中起一定作用.     

大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定

目的:探索大鼠主动脉原代内皮细胞体外培养方法,为体外研究提供细胞模型。方法:分离大鼠主动脉,直接贴壁于培养皿中,荧光倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色鉴定细胞。结果:约24小时组织块边缘有游离的新生细胞长出,7天即融合成片。消化传代后细胞呈短梭形或三角形,单层生长,铺路石状,Ⅷ因子表达阳性,呈指数增殖。冻存后复苏细胞活性均超过90%。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。     

改良的乳鼠原代心房肌细胞的培养及鉴定方法

目的:主要探讨原代心房肌细胞的培养及鉴定方法,为进一步研究心房颤动的重构机制及治疗方法奠定基础。方法:选取1-3 d的SD乳鼠40只,雌雄不限,分离心房、心室肌,胰酶联合EDTA充分消化心房肌细胞,利用心房肌与成纤维细胞的差速贴壁及细胞传代方法纯化心房肌细胞,免疫细胞化学染色鉴定心房肌细胞。结果:心房肌细胞培养至第3天,可见心房肌细胞覆盖率高达90%,并出现波动性,免疫细胞化学染色可见90%的心房肌细胞肌经α-肌动蛋白抗体染色阳性。结论:经酶化学消化法可成功培养出原代心房肌细胞,是一种较好的培养及鉴定乳鼠心房肌细胞的方法。     

血管内膜增生过程中核酸代谢相关酶活性变化的研究

目的和方法：应用血管内皮剥脱后再狭窄模型,动态观察胸腹主动脉壁核膜核苷三磷酸酶及核酸代谢和糖代谢相关酶5’—核苷酸酶、腺苷脱氨酶和琥珀酸脱氢酶活性的变化。探讨其与血管平滑肌细胞增生和新生内膜形成的关系。结果：血管内皮剥脱后,胸腹主动脉壁核膜核苷三磷酸酶活性持续升高,与血管内膜增厚程度相平行;血管平滑肌细胞收缩型标志蛋白α-肌动蛋白表达降低及合成型标志蛋白骨桥蛋白表达上调,说明血管平滑肌细胞发生了表型转化,由分化型转变成为去分化型;5’核苷酸酶、腺苷脱氨酶和琥珀酸脱氢酶活性表现为先升后降,三种酶活性均于血管平滑肌细胞增殖旺盛期(术后3～7d)达峰值。结论：细胞内参与mRNA转运及糖、核酸代谢的一系列酶活性的变化是新生内膜形成的生化基础。     

小鼠气管平滑肌原代细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种可靠的通过组织块贴壁法分离培养原代小鼠气管平滑肌细胞及免疫组化鉴定的方法。方法体视显微镜下立体分离小鼠气管平滑肌组织,组织块贴壁法培养原代细胞,对分离培养细胞通过免疫组化方法进行鉴定,并用MTT法对其增殖特性进行检测。结果从BALB/c雄性小鼠分离气管平滑肌组织,剪碎为1 mm3,用含1%青-链霉素的PBS及培养液漂洗,使组织块贴于培养皿底,并加入5 m L培养液,放入37℃、5%CO2的细胞培养箱培养,3~5 d后有明显梭状细胞从组织块爬出,5~6 d后,细胞可见明显"峰-谷"结构。经免疫荧光鉴定,在传代、纯化后,可得纯度为99%以上的气管平滑肌细胞。用MTT法测量其生长曲线。结论本方法操作简单、经济,获得的气管平滑肌细胞具有较好增殖能力,细胞数量和纯度能够满足后续细胞生物学实验研究的需要。     

前列腺基质细胞的原代培养方法

目的:建立一种操作简单、成功率高、重复性好的前列腺增生组织原代基质细胞(PSC)培养方法。方法:采用胶原酶消化法、组织块贴壁法和胰酶消化组织块贴壁法,从70岁及以上男性的良性前列腺增生组织中分离培养PSC,通过显微镜观察比较PSC的数量、形态、培养周期,用免疫荧光染色法鉴定PSC的纯度。结果:胶原酶消化法得到的贴壁细胞少,细胞体积较小且形态无法铺展,增殖能力较弱;组织块贴壁法培养72h后细胞会从组织边缘缓慢爬出,生长周期长;胰酶消化组织块贴壁法,细胞培养7d后基本融合,折光性强,细胞多呈长梭形,通过免疫荧光染色鉴定,基质细胞纯度在95%以上。结论:利用胰酶消化组织块贴壁法建立了一种易行、高效且重复性好的前列腺增生组织基质细胞培养方法。     

周细胞的原代培养

目的:探讨Wistar大鼠视网膜毛细血管周细胞(pericyte,PC)的原代培养和鉴定方法。方法:结合视网膜微血管的消化分离,采用含10%胎牛血清的DMEM培养基选择性培养PC,通过活细胞观察原代PC的形态、生长特性以及与血管碎片之间的关系,同时应用免疫细胞化学染色来鉴定PC。结果:选择性培养获得的PC的纯度达到95%以上,并能连续传代。该细胞呈长梭形或星芒状,漩涡或栅栏状生长,无接触性抑制,单核,偶见双核,核卵圆形,细胞浆丰富,α-SMA、PDGFR-β染色阳性。结论:通过对视网膜微血管的消化分离能够获得较为纯净的PC。     

成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

目的:建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法,并探索其生物学特性。方法:取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤,配制2种血清的细胞培养液,采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果:背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7 d无细胞游出,CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少;经组织块贴壁法细胞生长慢,培养周期长;酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少,得到细胞少;耳部皮肤取材方便,但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型;相较于对照组,UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论:CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案,可增加细胞得量、缩短培养周期,降低成本。