从噬菌体文库中筛选潜在的GM—CSF的拮抗剂

以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）为筛选文库的靶分子,通过高效筛选（Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ,ＨＴＳ）方法来筛选多种多肽噬菌体文库,在一个以噬菌体主要蛋白质为载体的多肽噬菌体文库中筛选到了一些与ＧＭ－ＣＳＦ结合的多肽,并通过了ＥＬＩＳＡ和微淘选（ｍｉｃｒｏｐａｎｎｉｎｇ）实验的证实,这些多肽先导化合物经过进一步的优化,可能成为ＧＭ－ＣＳＦ细胞因子的拮抗剂。     

从噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的多肽(英)

与许多疾病相关的血管生成作用是由一些血管生成因子介导的,其中就包括表皮生长因子.在肿瘤生长、关节炎等疾病中,表皮生长因子参与了其中的血管生成作用,拮抗表皮生长因子介导的血管生成就有可能对与其相关的疾病起到治疗作用,因此,表皮生长因子的拮抗剂可能具有重要的临床价值.拮抗表皮生长因子的作用可以通过许多途径,其中之一就是找到能与表皮生长因子结合并能干预其与受体结合的分子,因而表皮生长因子可作为药物靶分子.从噬菌体文库中筛选药物靶分子的拮抗剂和激动剂已被证明是一种有效的方法.以表皮生长因子作为药物靶分子,从多肽噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的噬菌体多肽,这些潜在的表皮生长因子拮抗剂先导分子经过优化可能具有重要的临床价值.     

从噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的多肽

与许多疾病相关的血管生成作用是由一些血管生成因子介导的 ,其中就包括表皮生长因子 .在肿瘤生长、关节炎等疾病中 ,表皮生长因子参与了其中的血管生成作用 ,拮抗表皮生长因子介导的血管生成就有可能对与其相关的疾病起到治疗作用 ,因此 ,表皮生长因子的拮抗剂可能具有重要的临床价值 .拮抗表皮生长因子的作用可以通过许多途径 ,其中之一就是找到能与表皮生长因子结合并能干预其与受体结合的分子 ,因而表皮生长因子可作为药物靶分子 .从噬菌体文库中筛选药物靶分子的拮抗剂和激动剂已被证明是一种有效的方法 .以表皮生长因子作为药物靶分子 ,从多肽噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的噬菌体多肽 ,这些潜在的表皮生长因子拮抗剂先导分子经过优化可能具有重要的临床价值 .     

GM—CSF和G—CSF的协同抗肿瘤作用

GM－CSF抗肿瘤方面的主要作用是与免疫分子联合使用治疗肿瘤;GM－CSF基因转入肿瘤细胞和树突状细胞中分别作肿瘤疫苗和细胞疫苗发挥抗肿瘤作用;GM－CSF和G－CSF用于缓解放疗和化疗后骨髓抑制。     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标记的非融合蛋白基因转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃ将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因成功地插入病毒ＡｃＮＰＶ的基因组中．ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在感染重组病毒的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）培养细胞Ｓｆ９中得到表达,感染后的Ｓｆ９细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达２．７×１０５５ＣＦＵ／ｍｌ。以ｈＧＭ－ＣＳＦ单抗所作的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ表明,表达的ｈＧＭ－ＣＳＦ对是３种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为１５ｋｄ,１８ｋｄ和２０ｋｄ。     

多肽噬菌体展示

噬菌体展示技术已被广泛地应用于生物学研究的各个方面.利用它可融合表达多肽、蛋白质结构域和蛋白质.尤其是多肽噬菌体展示,已被作为一种便利的研究工具去发现和研究那些与受体、酶、凝集素、抗体、核酸以及其他生物分子亲和的多肽配基和酶的底物专一性,该技术在药物的发现,疫苗的设计等医学领域也有着潜在的应用价值.     

枸橼酸酐对原核表达重组GM—CSF的修饰作用

根据枸橼酸酐对蛋白质中的游离氨基进行化学修饰后可使蛋白质溶解度提高的原理,以大肠杆菌表达的人重组ＧＭ－ＣＳＦ为模型,研究了枸橼酸酐修饰对含凝血酶识别位点的融合蛋白的作用,发现用微量的枸橼酸酐修饰的重组ＧＭ－ＣＳＦ变性,复性更容易,溶解度明显提高,并对凝血酶的消化更为敏感,使凝血酶用量降低１００倍,ＧＭ－ＣＳＦ活性测定结果证明枸橼酸酐修饰不影响其生物学活性,这些结果为枸橼酸酐修饰法在大肠杆菌表达重线     

人重组GM—CSF／HSA—D3嵌合蛋白（GM—HSA）在大肠杆菌中的表达及其产…

将人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人血清白蛋白第三功能区（ＨＳＡ－Ｄ３）的基因串联后,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获高效表达,表达量占菌体蛋白的３２．６％。利用ＴＦ－１体外细胞活性测定表明,ＧＭ－ＨＳＡ的活性单位为１．０４×１０＾６Ｕ／ｍｇ,虽然其比活性低于ＧＭ－ＣＳＦ,但比后者具有更高的体外热稳定性和储藏稳定性。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗柯萨奇病毒B3多肽的研究

本实验将柯萨奇病毒B3型(CVB3)大量扩增,应用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒.利用噬菌体随机9肽库进行筛选,3轮淘洗后,测定噬菌体克隆抗病毒复制能力.提取阳性克隆DNA并进行测序,推导外源多肽的氨基酸序列.结果表明3个具有明显抗病毒复制能力的噬菌体阳性克隆被筛选出来,使TCID50由10-7.5SFU/mL分别降至10-5.25、10-6、10-5.5SFU/mL,由此证明可以应用噬菌体肽库来筛选具有抗病毒作用的多肽,本研究为抗病毒多肽制剂的研究奠定了基础.     

利用噬菌体随机肽库筛选抗柯萨奇病毒B3多肽的研究

本实验将柯萨奇病毒B3型(CVB3)大量扩增,应用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒。利用噬菌体随机9肽库进行筛选,3轮淘洗后,测定噬菌体克隆抗病毒复制能力。提取阳性克隆DNA并进行测序,推导外源多肽的氨基酸序列。结果表明:3个具有明显抗病毒复制能力的噬菌体阳性克隆被筛选出来,使TCID50由10-7.5SFU/mL分别降至10-5.25、10-6、10-5.5SFU/mL,由此证明可以应用噬菌体肽库来筛选具有抗病毒作用的多肽,本研究为抗病毒多肽制剂的研究奠定了基础。     

在肽库中筛选抗磷脂抗体的小肽抑制剂

β２糖蛋白Ⅰ（ｂｅｔａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ,β２ＧＰＩ）是一分子量为５０ ｋＤ的糖蛋白．从抗磷脂抗体综合症（Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｙｎｄｒｏｍ ,ＡＰＳ）患者身上获得的抗体可直接与β２ＧＰＩ作用．以β２ＧＰＩ为目标分子,在噬菌体十五肽库中筛选抗β２糖蛋白Ⅰ抗体的小肽抑制剂．通过四轮亲和性筛选,噬菌体的回收率从１．２６×１０－ ４％ 增加到３．１９×１０－ ２％ ．随机挑取噬菌体克隆测定其与β２ＧＰＩ的结合活性及其对β２ＧＰＩ与自身抗体结合的抑制活性,其中部分噬菌体克隆表现出４０％ 的抑制活性．经ＤＮＡ 序列测定,得到一组相关序列．该结果为研究β２ＧＰＩ的抗原表位奠定了良好的基础．     

利用噬菌体肽库筛选与HIV-1p24抗原结合的多肽

通过噬菌体展示技术筛选出与HIV-1p24抗原结合的多肽,为用多肽辅助p24抗原检测提供实验基础.以重组p24抗原为靶蛋白,对噬菌体随机七肽库进行三轮筛选,用EUSA鉴定第三轮筛选到的噬菌体克隆与p24重组抗原的结合能力,再对噬菌体克隆进行测序分析,同时研究了ELISA中噬菌体加入量及多种封闭剂对噬菌体特异性结合能力的...     

噬菌体呈现肽库技术的应用

噬菌体呈现肽库是噬菌体显示技术的一个非常重要的分支。自问世以来,随着分子生物学技术的飞速发展,它已被广泛应用于免疫学、分子生物学、药理学、疫苗学等生命科学领域。简要概述了这一技术的应用。     

从噬菌体随机肽库中筛选流感病毒神经氨酸酶的抑制多肽

目的:从噬菌体呈现12肽库中筛选与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的肽。方法:以甲三型流感病毒裂解疫苗原液为靶分子,经过3轮生物淘选,从噬菌体随机肽库中筛选与之结合的噬菌体。用ELISA方法鉴定噬菌体克隆与靶分子的结合力,用荧光方法测定噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性。对筛选到的阳性克隆进行DNA序列测定并推导出相应的氨基酸序列。结果:经过3轮筛选后,42个噬菌体克隆与靶分子有高度亲和力,23个噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶有抑制活性。对27个噬菌体克隆的测序结果表明,分别有10个和2个克隆的序列是一致的,其氨基酸序列分别为KSLSRHDHIHHH和WPRHHHSASVQT。结论:通过噬菌体肽库筛选到抑制流感病毒神经氨酸酶的12肽,为进一步研究对流感病毒神经氨酸酶有抑制活性的分子药物奠定了基础。     

利用噬菌体展示肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒模拟抗原表位

目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的模拟抗原表位。方法：用IBV阳性血清纯化IgG作为靶标。对噬菌体展示随机12肽库进行筛选，通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并对阳性克隆提取ssDNA进行测序分析。结果：3轮生物淘洗后，目标噬菌体得到125倍富集。随机挑选50个克隆进行ELISA和竞争抑制ELISA。其中有12个噬菌体克隆可以与IBV阳性血清高特异性结合。测序分析发现，这12个克隆带有2种氨基酸序列。即KSPKHSSSALHF和SFFQLNLHRPTS。且未发现这2种序列与GenBank中已发表的IBV氨基酸序列有同源性。结论：结果提示。这2个肽可能是IBV抗原的模拟表位。