淡水瓦氏雅罗鱼基因文库的构建和抗冻蛋白基因同源序列的筛选

极地海域中的鱼类非常耐寒。它们的血液里常含有两种能降低其体内冰点的蛋白质：抗冻糖蛋白（AFGP）和不含糖的抗冻蛋白或抗冻多肽（AFP）。这些蛋白的编码基因已经被克隆,并将黄盖鲽AFP导人虹鳟鱼和大西洋鲑鱼,而改变了它们的抗冻基因进行了分离研究。所用实验材料鱼为中国内蒙古北部生活的瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii),属鲤形目（Lypciniformes),鲤科（Lyprinidae),雅罗鱼亚科（Leucisinae),基本按标准方法构建瓦氏雅罗鱼的基因库。只在包装反应至30分钟时,再加一份BHB2690制备物,并延长30分钟反应时间。所得库的成斑率大于1×10^5pfu。已知AFP基因常常多至40个拷贝,故已够用。采用通用的原位分子杂交和Southern分析进行瓦氏雅罗鱼AFP基因同源序列的分离及其亚克隆分析。以北美黄盖鲽AFP基因片段为探针,从瓦氏雅罗鱼DNA库中筛选了三个阳性克隆。图一所示为其中一个的双份膜及其复筛结果。图二为这个阳性克隆DNSA经过三种限制酶切后,同时与北美黄盖鲽AFP基因片段和该基因0．4KbcDNA两种探针的southern分析结果。其中Sac酶切在两个杂交中的均能产生一条2．7Kb的杂交带。图三对两个阳性克隆的southern分析证明：对这个杂交片段的亚克隆是成功的。这是首次在中国一种耐寒淡水鱼基因组内发现并得到AFP基因同源序列,将用于转基因鱼的研究。     

中国对虾cDNA文库的构建

中国对虾ｃＤＮＡ文库的构建ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮＯＦｃＤＮＡＬＩＢＲＡＲＹＯＦＳＨＲＩＭＰＰＥＮＡＥＵＳＣＨＩＮＥＮＳＩＳ（ＣＲＵＳＴＡＣＥＡ,ＤＥＣＡＰＯＤＡ）关键词中国对虾ｃＤＮＡ文库构建ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ,ｃＤＮ...     

编码天麻抗真菌蛋白cDNA的分子克隆

用重组ＤＮＡ 技术研究了编码天麻抗真菌蛋白（ＧＡＦＰ）的基因,从天麻（Ｇａｓｔｒｏｄｉａ ｅｌａｔａＢｌ．）块茎中提取Ｐｏｌｙ（Ａ） ｍ ＲＮＡ 后合成ｃＤＮＡ,构建成表达型ｃＤＮＡ 文库,用纯化的蛋白质探针通过免疫筛选找出对应的ｃＤＮＡ 克隆。在进一步证明所选用的ｃＤＮＡ 克隆含有重组的λ－ｐｈａｇｅ ＤＮＡ 后,提取和纯化含有插入片段重组子的ＤＮＡ,用Ｅｃｏ ＲＩ酶切分析可见插入片段。已分离出编码天麻抗真菌蛋白的基因     

RT－cDNA克隆－PCR法获取犬瘟热病毒融合蛋白基因（F）

纯化鸡胚成纤维细胞培养的犬瘟热病毒（ＣａｎｉｎｅＤｉｓｔｅｍｐｅｒＶｉｒｕｓ,ＣＤＶ）,获得病毒基因组ＲＮＡ后,反转录合成双链病毒Ｆ基因ｃＤＮＡ。将此双链ｃＤＮＡ平端插入ＰＵＣ１９质粒ＳａｍⅠ位点构建重组质粒,进行ｃＤＮＡ克隆。以重组克隆质粒为模板ＰＣＲ扩增,获得ＣＤＶ全长Ｆ基因。将此Ｆ基因插入表达载体ＰＢＶ２２０,在大肠杆菌中表达,通过对表达产物的最终鉴定,可确认所获片段为ＣＤＶ全长Ｆ基因．     

玉米苹果酸脱氢酶基因的分离与结构分析

以一个玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）杂种一代超亲表达的ｃＤＮＡ片段为探针,从玉米幼苗期ｃＤＮＡ文库中筛选到一个全长１２８７ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆。序列分析表明,该ｃＤＮＡ编码细胞质苹果酸脱氢酶,推导的氨基酸序列与龙须海棠（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｕｍ　Ｌ．）及拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）同一编码基因的氨基酸序列同源性分别为９０％和８４％。这是禾谷类作物中首次克隆的编码细胞质苹果酸脱氢酶的完整基因。     

美洲拟鲽抗冻肽基因在E.coli中的表达

动物抗冻肽（ＡＦＰ）以降低动物体液冰点而使其能在寒冷的环境中生活,因而ＡＦＰ在防寒抗冻方面有较大的潜力。根据美洲拟鲽ＡＦＰ基因的ｃＤＮＡ序列,人工合成了ＡＦＰ及春含前导序列的ｐｒｏＡＦＰ的ｃＤＮＡ,并构建成ＰＡＦＰ及ＰＰＡＦＰ原核表达载体。由于ＡＦＰ表达量少且蛋白分子很小,用ＳＤＳ－蛋白电泳难以检测。为了提高检测的灵敏度,把报道基因ＣＡＴ的ＣＤＮＡ按读码框连接到ＡＦＰ的３＇末端,构建成融合基因表达     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段的克隆与颗粒体蛋白基因的定位

用ｐＵＣ１９质粒作载体,克隆了黄地老虎颗粒体病毒（Ａｇｒｏｌｉｓｓｅｇｅｔｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,简称ＡｓＧＶ）ＤＮＡＰｓｔＩ－Ｄ．Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｊ．Ｋ．等７个片段。以［￣（３２）Ｐ］－ｄＣＴＰ标记的油桐尺蠖核型多角体病毒（Ｂｕｚｕｒａｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａｎｕｃｌｃａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ简称ＢｓＮＰＶ）多角体蛋白基因为探针,在３７℃条件下对ＡｓＧＶ）颗粒体蛋白基因进行了定位,将其分别定位于ＢｓｌⅡ－Ｓ或ＴＰｓＴＩ－Ａ或Ｂ和ＥｃｉＲＩ－Ａ片段上。     

鼻咽癌中差异表达基因的分析和克隆

为了验证通过ＣＤＮＡ代表性差性分析法（ｃＤＮＡ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ,ｃＤＮＡ ＲＤＡ）分离的ＣＤＮＡ序列在鼻咽癌活给组织中的差异表达,并进一不克隆鼻咽癌差异表达基因,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法并结合Ｎｏｔｔｈｅｒｎ杂交确定其转录本的大小,进而充分利用生物信息学对有差异表达ＣＤＮＡ全长进行克隆,并对其基因产物进行了结构和功能预测。结果显示,ＡＦ０９１５     

瓦草中三个新环肽

从云南民间中草药瓦草（Ｓｉｌｅｎｅｓｚｅｃｈｕｅｎｓｉｓ）的根中分离鉴定了３个新的环肽,分别命名为瓦草环肽Ａ,Ｂ,Ｃ（ｓｉｌｅｎｉｎｓＡ,Ｂ,Ｃ）用光谱和化学方法确定它们均为环八肽,其结构分别为：ｓｉｌｅｎｉａＡ－ｃｙｃｌｏ－（Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ）,ｓｉｌｅｎｉｎＢ－－ｃｙｃｌｏ－（Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ）,ｓｉｌ     

人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆,cDNA5‘端修饰及在大 …

采用ｃＤＮＡ－ＰＣＲ技术,从人胎盘ｃＤＮＡ文库ＤＮＡ中克隆了人碱性成纤维在子（ｈｂＦＧＦ）基因,用ＰＣＲ突变法对其５＆端序列进行修饰,奖天然和修饰后的ｈｂＦＧＦ基因分别克隆至表达载体ｐＢＶ２２１,免疫抑迹和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果证明,经修饰后的基因在大肠杆菌ＤＳ５α中获得了表达,表达量占菌体总蛋白９％。     

酶母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报道基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏ８ｍｙｃｅｓｅ ｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比     

拟南芥LFYcDNA的克隆及转化菊花的研究

以野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）为材料,克隆并测序了Ｌｅａｆｙ（ＬＦＹ）基因的全长ｃＤＮＡ;同时构建了ＬＦＹｃＤＮＡ以ＣａＭＶ３５Ｓ为启动子的植物表达载体,并转化菊花（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ（Ｒａｍａｔ．）Ｔｚｖｅｌ．）。该ｃＤＮＡ全长１２６３ｂｐ,共编码４２０个氨基酸残基,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ＬＦＹｃＤＮＡ整合到菊花染色体组中。跟正常植株相比,转基因植株中有３株分别提早６５、６７、７０ｄ开花,２株分别推迟７８、９０ｄ开花。     

酵母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报告基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比值,确定它们的功能强度,其中ｐＳＫ－ｋａｎ４０１－４１和ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５－５１两个克隆的插入片段具有较强的启动子功能,并证明这两个片段在酵母Ｋ．ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ中也有启动子功能。     

蝶兰胚珠发育基因的表达及序列分析

对从蝶兰（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓｓｐ．）成熟胚珠的ｃＤＮＡ文库中获得的ｃＤＮＡ克隆Ｏ１３８的时空表达特性和序列进行了分析。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分子杂交结果显示出该基因的ｍＲＮＡ在成熟胚珠和根中大量积累,但在大孢子母细胞时期的胚珠和子房组织中积累水平很低。ＤＮＡ序列分析表明,该基因含一个编码２８４个氨基酸,分子量为３０ｋＤ蛋白的开放阅读框架。Ｏ１３８是一个与成熟胚珠发育相关的基因。     

拟南芥AtJ3基因的克隆和分析

克隆并分析了拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）ＡｔＪ３的ｃＤＮＡ核苷酸序列,并证明其翻译产物与Ｅ．ｃｏｌｉ的ＤｎａＪ蛋白高度同源。ＡｔＪ３蛋白分子中具有全部这类蛋白的典型特征包括Ｊ结构域（ｄｏｍａｉｎ）、Ｇ或ＧＦ结构域、富含半胱氨酸的锌指结构域,Ｃ末端的ＣＡＱＱ是一个蛋白法尼基化信号。用ＡｔＪ３的ｃＤＮＡ序列末端非翻译区作探针,从拟南芥基因组文库中分离获得ＡｔＪ３基因。基因序列分析表明该基因是由被５个内含子分隔的６个外显子组成。根据Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,ＡｔＪ３基因为单拷贝基因。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析结果表明,ＡｔＪ３在子叶、叶、根、花及长角果中都表达。３５℃的热激能增加叶中ＡｔＪ３的ｍＲＮＡ表达     

辣椒疫霉产毒共分离RAPD标记的研究

辣椒疫霉（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃｏｐｓｉｃｉ）毒素的产生是由一个不完全显性基因所控制,通过ＲＡＰＤ／ＢＳＡ分析证明,用ＯＰＷ１２扩增得到一条约１３００ｂｐ的ＲＡＰＤ标记带,该带与辣椒疫霉产毒共分离。纯化回收ＯＰＷ１２　１３００ＤＮＡ,共转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ,筛选出３个白色阳性克隆,序列分析发现该标记ＤＮＡ为１２９１ｂｐ。这一标记ＤＮＡ序列的阐明为进一分析产毒遗传机理提供了新的信息。     

辣椒疫霉产毒共分离RAPD标记的研究

辣椒疫毒（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）毒素的产生是由一个不完全显性基因所控制,通过ＲＡＰＤ／ＢＳＡ分析证明,用ＯＰＷ１２扩增得到一条约１３００ｂｐ的ＲＡＰＤ标记带,该带与辣椒疫霉产毒共分离。纯化回收ＯＰＷ１２１３００ＤＮＡ,共转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α,筛选出３个白色阳性克隆,序列分析发现该标记ＤＮＡ为１２９１ｂｐ。这一标记ＤＮＡ序列的阐明为进一步分析产毒遗传机理提供了新的信息     

辣椒疫霉产毒共分离RAPD标记的研究*

辣椒疫霉（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃｏｐｓｉｃｉ）毒素的产生是由一个不完全显性基因所控制,通过ＲＡＰＤ／ＢＳＡ分析证明,用ＯＰＷ１２扩增得到一条约１３００ｂｐ的ＲＡＰＤ标记带,该带与辣椒疫霉产毒共分离。纯化回收ＯＰＷ１２　１３００ＤＮＡ,共转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ,筛选出３个白色阳性克隆,序列分析发现该标记ＤＮＡ为１２９１ｂｐ。这一标记ＤＮＡ序列的阐明为进一分析产毒遗传机理提供了新的信息。     

植物发育基因克隆技术的新进展

过去２０年,人们已经分离到了相当数量的与发育相关的基因。这主要借助于蛋白质产物的分离纯化,然后根据其氨基酸结构推算其相应的核苷酸序列,并据此合成寡核苷酸探针,最终从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中筛选出目的基因。而未知其编码产物的发育基因的分离克隆则是非常困难的工作,以前广泛应用的主要方法有ＤＮＡ标签法（ＤＮＡｔａｇｇｉｎｇ）［１,２,３］,作图克隆法（ｍａｐ－ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇ）［４］,差别筛选法（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）［５］和扣除杂交法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［６,７,８］。这些方法虽然都取得了一定的成功,但由于各自的缺陷性,而限制了它们更加广泛的应用。近年来在ＰＣＲ技术的基础上,人们已经建立了若干种分离克隆植物发育基因的新方法。１９９２年,ＬｉａｎｇＰ和ＰａｒｄｅｅＡ［９］首次提出并运用了ｍＲＮＡ差别显示技术（ｍＲＮＡｄｉｆ－ｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ,ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）来进行基因的分离。实践表明,ｍＲＮＡ差别显示技术在分离、鉴定差别表达的新基因方面与以前的各种技术相比有其独特的优越性,但同时它也存在着重复性较差等缺点。因此,最近研究工作者又在其基础上,发展了诸如代表性差式分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ,ＲＤＡ）［１０,１１］和抑制性扣除（或减去）杂交（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ,ＳＳＨ）［１２］等一些更新的方法。下面就此作一简要概述。     

抗水稻条纹叶枯病毒核酶的设计,克隆及体外活性测定

为探索控制水稻条纹叶枯病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ,ＲＳＶ）设计合成了特异切割该病毒ＲＮＡ保守区及编码病害特异性蛋白（ＤｉｓｅａｓｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰ）基因的核酶,核酶基因的长度均为４０个碱基,用化学合成方法合成其正链及与其３＇－末端互补的１５个碱基引物,用ＴａｇＤＮＡ多聚酶合成其互补链。双链ＤＮＡ直接插入克隆载体ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点。序列测定表明,克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致。经ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶体外转录得到核酶ＲＮＡ。当核酶ＲＮＡ与以同样方法转录得到的靶基因ＲＮＡ混合反应,可得到预期结果相同的切割片段,表明两种核酶在体外均具有特异性切割活性。