MNNG转化赤麂细胞株（KIZ—8401）的生长特性和核型观察

本文用MNNG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)(甲基硝基亚硝基胍)转化赤麂肺成纤维细胞株(KIZ-7901)。转化的赤麂细胞株(KIZ-8401)具有新的核型,2n=8♂,细胞形态,细胞周期以及生物学特性都与未转化的细胞株(2n=7♂)不一样。转化细胞中还常见多倍体出现,细胞具有克隆生长能力。     

细胞培养中癌变原理的研究——Ⅱ.用胰蛋白酶-G-分带法对转化的和正常的金仓鼠乳鼠肺细胞核型的比较分析

用胰蛋白酶-G-分带法对用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)转化的金仓鼠乳鼠肺细胞及未转化正常细胞的核型进行了比较分析。为了便于控制胰蛋白酶处理的时间,采用较稀的(0.01%)胰蛋白酶溶液,在室温和pH 8.2条件下处理1—3分钟,然后染色(两步法);或将胰蛋白酶直接加在染液中(一步法),均取得较好的结果。用MNNG 转化的金仓鼠乳鼠肺细胞BHLB-4 系,其染色体众数仍保持二倍性,但用G-分带法进行核型分析的结果表明,某些表面上看来是二倍体的分裂相,其核型实际上是不正常的,表现为某些染色体的单体性或三体性,并出现额外染色体,故称之为假二倍体核型。由此可见,在转化过程中,金仓鼠乳鼠肺细胞的核型发生了一定的改变,但除第8号染色体单体性的出现频率较高(7/20)外,未发现其他规律。     

大鼠胃炎癌转化模型建立与早期诊断方法探索

目的构建大鼠胃炎癌转化模型,探索新的胃癌早期血清学诊断指标。方法采用N-甲基-N'-硝基-N'-亚硝基胍饮水(MNNG)协同高盐饲料喂养的方法诱导大鼠胃炎癌转化模型。核磁共振成像及组织病理学观察大鼠胃部恶化过程。qRT-PCR检测不同时间点(造模第0,12,24,36,48周)大鼠血清miR-17-5p和miR-374-5p表达水平。结果 MNNG饮水协同高盐饲料喂养成功诱导大鼠胃炎癌转化,经历萎缩性胃炎(造模第24周)和不典型增生(造模第48周)的过程。血清中miR-17-5p和miR-374-5p的表达水平与大鼠胃部恶化程度正相关。与正常对照组相比,第36、48周时,miR-17-5p表达水平分别增加约8倍(t=4.12,P0.001)和10倍(t=5.33,P0.001);第48周时,miR-374-5p表达水平增加约6倍(t=3.62,0.001P0.002)。结论MNNG饮水协同高盐饲料喂养构建的大鼠胃炎癌转化模型为研究胃癌发病机理提供了良好的动物模型,血清miR-17-5p和miR-374-5p是潜在的胃癌早期无创诊断指标。     

非律平菌素干扰甲基硝基亚硝基胍对FL细胞鞘脂代谢的影响

甲基硝基亚硝基胍（MNNG）可通过脂筏诱导细胞表面受体聚簇并激活NF-κB信号通路.本研究拟探讨脂筏干扰剂非律平菌素（filipin）对MNNG作用的影响.利用脂类组学方法分别研究了MNNG、filipin 单独处理及先用filipin再用MNNG处理情况下对人羊膜FL细胞鞘脂代谢的影响,用MALDI-TOF质谱法分析细胞鞘脂组成的变化,酶联免疫吸附法检测NF-κB通路的活化,RT-PCR法检测鞘脂代谢通路中关键酶的表达.结果表明,MNNG和filipin都可影响FL细胞鞘脂类代谢,但MNNG作用更显著.Filipin预处理可部分抑制MNNG对细胞鞘脂类代谢的影响,且能够抑制MNNG对NF-κB的活化;但filipin、MNNG单独或联合处理都不影响鞘脂代谢关键酶丝氨酸棕榈酰转移酶、酸性鞘磷脂酶和鞘磷脂合成酶在mRNA水平的表达.以上结果说明,filipin预处理会导致甲基硝基亚硝基胍引起FL细胞鞘脂代谢以及NF-κB活性的改变.而可能的机制在于,filipin破坏脂筏结构从而引起一系列信号途径的改变,而非通过改变脂类代谢关键酶的表达.     

用MNNG体外诱发人胚肺成纤维细胞的肿瘤性转化

本实验用直接致癌物MNNG处理体外培养的人胎儿肺成纤维细胞的早代培养物,诱发了肿瘤性转化,包括形态改变,转化灶的形成、较高的饱和密度,半固体琼脂培养基中较高的集落形成率,染色体畸变,寿命延长,鸡胚皮肤浸润以及异种接种形成了肿瘤。在实验中,通过不同剂量,不同次数的处理,在一定的范围内得到了剂量、处理次数与肿瘤性转化的正相关。     

单功能烷化剂MNNG对人胃粘膜上皮GES-1细胞的损伤及其对Wnt/β-catenin信号通路的影响

本文旨在从Wnt/β-catenin信号通路的角度探讨单功能烷化剂MNNG诱导人胃粘膜上皮GES-1细胞损伤的机制。用MNNG(2×10-5 mol/L)处理GES-1细胞24 h,处理后第3天用倒置显微镜对GES-1细胞形态进行观察,用MTT法检测GES-1细胞活力,用流式细胞术检测GES-1细胞凋亡和周期变化,用q PCR检测GES-1细胞中β-catenin、GSK-3β、c-Met和MMP7m RNA表达情况,用Western blot检测β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和c-Met蛋白表达情况。结果显示:MNNG能够明显损伤GES-1细胞,细胞形态变为不规则的长梭形;MNNG能够诱导GES-1细胞凋亡,明显阻滞细胞周期进程;MNNG能够上调β-catenin、GSK-3β、c-Met和MMP7 m RNA表达水平,并上调β-catenin、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达水平。上述结果提示,MNNG对GES-1细胞的损伤可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关,这为胃粘膜损伤的细胞模型研究提供了参考。     

MNNG对细胞DNA合成及其分布的影响

本文用流式细胞光度术(FCM)等方法研究了MNNG,ENNG和DMS对HeLa细胞DNA含量分布的影响。经MNNG(6.8μmol/L)处理后,细胞分裂减少,DNA合成速率下降,S期细胞的比例随处理时间的延长而增加。DMS显示有类似的现象而ENNG的效应则较小。     

以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍（MNNG）诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6～2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1～2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。     

以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍(MNNG)诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6~2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1~2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。     

类核沉降法对三个着色性干皮病(XP)家系成员DNA修复能力的测定及杂合子的检出

应用类核沉降法,分析了三个着色性干皮病家系中35名成员外周血淋巴细胞在紫外线(2.5μJ/mm~2)照射和MNNG(2μg/mI)损伤后DNA修复能力。结果表明,6名XP患者和9名杂合子DNA损伤后20小时尚不能完成修复,他们11小时DNA修复率均值分别为UV,0.61±0.13,0.59±0.15和MNNG,0.44±0.15,0.46±0.16,与家系中10名非血缘亲属正常人DNA修复率均值为UV,0.96±0.07,MNNG,0.71±0.07相比,差异非常显著(Ρ<0.01),而XP患者和杂合子DNA修复率则无显著性差异(Γ>0.05)。提示,类核沉降技术可能为XP家系中杂合子成员检出提供一种有希望的方法。     

MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞中错配修复功能的研究

在MNNG诱发的延迟发生的,以非定标性突变形成为特征的遗传不稳定vero细胞抽提物中,应用凝胶阻滞和体外错配修复技术,发现仍存在特异性针对G·T的错配结合蛋白,能选择性识别并结合DNA中的G·T错配;同时发现在该细胞核抽提物中G·T错配能被有效、特异地修复成G·C。经与正常vero细胞比较,证实二者功能均无缺陷。从而排除了MNNG通过对错配结合蛋白及G·T错配修复功能的损伤而诱发细胞遗传不稳定的可能机制。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅱ)热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体的诱变育种

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79经 MNNG诱变后获得产长链二元酸突变株N—26,十三烷1:13二羧酸产量为10克/升。N-26％用秋水仙碱和樟脑分别诱发产生多倍体细胞 NP_(CO)2和NP_(Oa)18,十三烷1:13二羧酸产量分别提高到17.3克/升和18.3克/升。多倍体NP_(CO)2和NP_(Oa)18的个体大,生长速率快,DNA含量分别为3.2×10~(-6)微克/细胞和4.O×10~(-6)微克/细胞,而 N-26则为1.6×10~(-6)微克/细胞。 多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18对MNNG均较敏感,致死率较N—26高一倍,诱变之总突变频率则较原种高8—10％,以0.25毫克/毫升MNNG处理时正突变频率可提高一倍左右,因此获得高产突变株的机率显著提高。从多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18经0.25毫克/毫升MNNG处理所得高产菌株、NP_(CO)N22和 NP_(Oa)N39,十三烷 1:13二羧酸的产量分别提高到33.5克/升和34.5克/升。 对多倍体高产变种生理特性的初步观察指出多倍体细胞较易为蜗牛细胞壁溶解酶作用生成原生质体,电子显微镜初步观察指出多倍体细胞的细胞壁可能较薄。 离体酶活力的测定指出多倍体变种的三羧酸循环酶系、呼吸链酶系和过氧化氢酶活力增加,因而推测多倍体变种之所以提高长链二元酸的产量可能是由于ATP的供应增加,促进了烷烃的氧化,而过氧化氢酶的增加可能是对于烷烃氧化过     

L—赖氨酸产生菌的选育

本研究是从179(HS-、AEC~r)为出发菌株经 MNNG(亚硝基胍)诱发,选得缺陷型回复突变株 T36-10(HS 、AEC~r),产酸48mg/ml,但遗传性不稳定。又将该菌株分离于含甲硫氨酸的培养基上,得到抗甲硫氨酸的三重突变株,并     

A Lipidomic Study of the Effects of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine on Sphingomyelin Metabolism

Systems biology is a new and rapidly developing research area in which,by quantitativelydescribing the interaction among all the individual components of a cell,a systems-level understanding of abiological response can be achieved.Therefore,it requires high-throughput measurement technologies forbiological molecules,such as genomic and proteomic approaches for DNA/RNA and protein,respectively.Recently,a new concept,lipidomics,which utilizes the mass spectrometry(MS)method for lipid analysis,has been proposed.Using this lipidomic approach,the effects of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)on sphingomyelin metabolism,a major class of sphingolipids,were evaluated.Sphingomyelin moleculeswere extracted from cells and analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight MS.Itwas found that MNNG induced profound changes in sphingomyelin metabolism,including the appearance ofsome new sphingomyelin species and the disappearance of some others,and the concentrations of severalsphmgomyelin species also changed.This was accompanied by the redistribution of acid sphingomyelinase(ASM),a key player in sphingomyelin metabolism.On the other hand,imipramine,an inhibitor of ASM,caused the accumulation of sphingomyelin.It also prevented some of the effects of MNNG,as well as theredistribution of ASM.Taken together,these data suggested that the lipidomic approach is highly effectivefor the systematic analysis of cellular lipids metabolism.     

L-赖氨酸产生菌A—111的研究

以产生谷氨酸的菌株2305作为出发菌株,经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(简写为MNNG)和赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)诱变处理,获得高丝氨酸缺陷型和抗AEC的产L-赖氨酸菌株A-111。本文报道该菌株的筛选方法、发酵条件试验、扩大试验结果。     

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍对短小芽孢杆菌AS 1.271菌株的诱变作用

1. MNNG在 pH6时较为稳定,在碱性条件下分解极为迅速,较易受光照作用而分解。 2．MNNG诱发短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) AS 1.271 菌株获得最高突变率的适宜条件是：菌龄为对数生长期的早期,采用0．05M pH6的TM缓冲液,所用剂量为1000微克／ 毫升,于30℃处理45分钟,在这样的处理条件下,营养缺陷型突变菌株可达20％左右。 3．在所获得的1775株突变菌株中,有947株经过营养缺陷型的鉴定,其中有核酸碱基、氨基酸、维生素的单一和双重营养缺陷型突变体,核酸碱基缺陷型中,腺嘌呤缺陷型较多,氢基酸缺陷型中以组氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、精氨酸等缺陷型所占的比例较大。     

反义阻断抑制非定标性突变相关基因后Vero细胞蛋白质组的表达差异

用mRNA差异显示和反义技术筛选到一个片段（片段9）相关基因（fragment 9 related gene,FNR基因）具有抑制甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱发的哺乳类细胞非定标性突变发生的功能。为研究FNR基因的功能机制，利用双向凝胶电泳结合相应的2D分析软件比较反义阻断FNR基因的Vero-pM-amp^-9^-细胞和转染空载体的对照细胞Vero-pM-amp^-在MNNG处理后细胞蛋白质组的表达差异。分析结果显示有12个点仅在Vero-pM-amp^-细胞中检测到，2个点仅在Vero-pM-amp^--9^-细胞中检测到，统计结果显示有24个点Vero-pM-amp^--9^-细胞表达量高于Vero-pM-amp^-细胞（P＜0.05），其中有7个点表达量高于5倍以上。说明该基因被反义阻断后有一系列基因表达水平的改变，同时也为进一步鉴定与识别非定标性突变发生相关的蛋白质及相应的基因提供线索。     

A Lipidomic Study of the Effects of N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine on Sphingomyelin Metabolism

Systems biology is a new and rapidly developing research area in which, by quantitatively describing the interaction among all the individual components of a cell, a systems-level understanding of a biological response can be achieved. Therefore, it requires high-throughput measurement technologies for biological molecules, such as genomic and proteomic approaches for DNA/RNA and protein, respectively.Recently, a new concept, lipidomics, which utilizes the mass spectrometry （MS） method for lipid analysis,has been proposed. Using this lipidomic approach, the effects of N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine （MNNG） on sphingomyelin metabolism, a major class of sphingolipids, were evaluated. Sphingomyelin molecules were extracted from cells and analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight MS. It was found that MNNG induced profound changes in sphingomyelin metabolism, including the appearance of some new sphingomyelin species and the disappearance of some others, and the concentrations of several sphingomyelin species also changed. This was accompanied by the redistribution of acid sphingomyelinase （ASM）, a key player in sphingomyelin metabolism. On the other hand, imipramine, an inhibitor of ASM,caused the accumulation of sphingomyelin. It also prevented some of the effects of MNNG, as well as the redistribution of ASM. Taken together, these data suggested that the lipidomic approach is highly effective for the systematic analysis of cellular lipids metabolism.     

化学诱变剂对粳稻花粉愈伤组织的诱导和分化以及花粉植株性状变异的影响

用甲基磺酸乙酯(EMS)、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)和乙烯亚胺(EI)在3～4种不同浓度(EMS:2.5,3.5,4.5ml/1;MNNG:25,50,100mg/1;EI:0.25,0.5,0.75,1.0ml/1),不同温度(8,18,27℃)和不同时间(2,4,8,10,20,30小时)水平上处理离体培养早期的粳稻花药,观察到诱变剂在低剂量和较低温度下处理,明显提高花粉愈伤组织的诱导率;随着诱变剂剂量增加和温度增高,愈伤组织诱导率下降,在这种情况下,虽对愈伤组织总的分化率未见明显影响,但白苗所占百分数显著增加。 在所诱导的120个花粉植株H_2株系中,观察到有6个株系出现性状大突变,主要是株高、成熟期和结实率的变异,变异的性状基本是稳定的并能够遗传。未经诱变剂处理所培养的花粉植株H_2株系,未见性状大突变出现。     

细胞DNA低甲基化是否为化学致癌启动过程的必经途径?

利用限制性内切酶分析技术研究化学致癌物对人羊膜FL细胞新合成DNA甲基化水平的影响,发现弱遗传毒性致癌物5-杂氮胞苷和L-乙硫氨酸可抑制HpaⅡ识别位点的甲基化,但是强诱变剂/致癌剂MNNG和黄曲霉素B_1对同一顺序DNA的甲基化却没有作用。所以抑制哺乳类DNA的胞嘧啶甲基化是部分而非全部致癌剂的特殊致癌启动机制。