单细胞实时监测Photofrin-PDT作用下Bax蛋白的动态分布

细胞凋亡是机体生命活动中重要的细胞学事件,在许多疾病的治疗中也起着关键性的作用。在多种凋亡因子刺激下,Bax的构象发生改变,寡聚化,插入线粒体外膜上。虽然关于Bax蛋白的研究已经取得了很大进展,但是Bax蛋白是如何转位到线粒体以及如何引起细胞色C释放等许多问题尚未十分清楚。为了进一步对Bax蛋白的生物学行为进行研究,特别是在无损伤、活细胞生理条件下,本实验采用了荧光蛋白标记和荧光成像技术对PDT作用凋亡过程中Bax蛋白在活细胞内分布的动态过程进行了初步研究。结果表明:在没有PDT作用时,Bax蛋白比较均匀地分布在整个细胞内,而PDT处理15分钟后,Bax蛋白开始不均匀分布在整个细胞,定位在线粒体上。该研究为今后使用荧光蛋白标记的方法在无损伤、活细胞生理条件下研究Bax蛋白定位机理以及如何诱导细胞色素C释放等问题打下了坚实的基础。     

BID蛋白因子诱导脂质体的渗漏和聚集

在大多数真核细胞凋亡中 ,线粒体扮演重要的角色。经一些因子诱导线粒体能释放细胞色素c、诱导凋亡因子 (AIF)等 ,从而引起一系列凋亡酶的激活反应 ,最后导致凋亡。Bcl-2家族蛋白具有调节线粒体释放细胞色素c和其它凋亡因子的作用 ,其中BID ,BAX ,BAK具有促进作用 ,而另一类Bcl-XL 则具有抑制作用。Bcl -2家族蛋白成员含有一些保守的微区称BH1 ,BH2 ,BH3 ,BH4等。BID分子只含有BH3微区。BID经凋亡酶8(Caspase8)处理后成为截短的Bid(truncatedBid,tBid),它能使线粒体明显渗漏或聚集 ,后者可在细胞核周围观察到这一现象。我们前曾报道tBid能诱导单层大脂体 (LUV )内包的胰蛋白酶或细胞色素c释放 ,本文研究并比较Bid ,tBid ,NBid(Bid分子的N端部分 )CBid(Bid分子的C端部分 )以及Bid的突变体 -Bid(D59A)和Bid(G94E)诱导LUVs释出内包的胰蛋白酶。结果表明 ,CBid、Bid和tBid具有相似的效果 ,而NBid ,Bid的两种突变体Bid(D59A)和Bid(G94E)则不能。如果比较上述几种蛋白因子与大豆磷脂脂质体的亲和力 ,其大小与它们诱导脂质体内包的胰蛋白酶泄出的能力相平行 ,即 ,tBid>Bid>Bid(D59A) ,而NBid和Bid(G94E)则几乎不能与脂质体相结合。Bid诱导脂质体的泄漏也与其磷脂组份有密切关系。脂质体中酸性磷脂 (如磷脂酸PA     

Bcl—2家族蛋白与细胞凋亡

Bcl 2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。在线粒体上 ,Bcl 2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用 ,调控线粒体结构与功能的稳定性 ,发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Bcl 2家族包括两类蛋白质 :一类是抗凋亡蛋白 ,另一类是促凋亡蛋白。在细胞凋亡时 ,Bcl 2家族中的促凋亡蛋白成员发生蛋白质的加工修饰 ,易位到线粒体的外膜上 ,引起细胞色素c、凋亡诱导因子等其他促凋亡因子的释放 ,导致细胞凋亡 ;而平时被隔离在线粒体等细胞器内的该家族的抗凋亡蛋白成员则抑制细胞色素c和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放 ,具有抑制细胞凋亡的功能。但一旦这类抗凋亡蛋白成员与激活的促凋亡蛋白发生相互作用后 ,便丧失了对细胞凋亡的抑制作用 ,造成线粒体等细胞器的功能丧失和细胞器内促凋亡因子的释放 ,导致细胞凋亡。现以Bcl 2家族调控细胞凋亡的最新研究进展为基础 ,对Bcl 2家族成员及其蛋白质结构、分布和调控细胞凋亡的分子机制进行综述。     

促细胞凋亡因子Bid蛋白的研究进展

Bid蛋白是Bcl-家族中促凋亡类的蛋白。它具有可被caspase8酶切高控、高效地诱民细胞色素c从线粒体泄漏到胞浆中的功能,从而在细胞凋亡中起着重要的作用,因而倍受人们的重视。Bid蛋白的功能被发现以来,短短几年间,人们从分子生物学、细胞学、结构分析以及利用脂质体模型膜体系等各方面对Bid蛋白进行研究,取得了很大的进展。     

高糖通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡

线粒体途径是细胞凋亡的重要途径之一. 在特定的刺激下,例如高糖条件,可以通过caspase依赖性和非依赖性两种途径诱导多种细胞凋亡.但线粒体凋亡途径在高糖引起成骨细胞凋亡中所起的作用,目前尚不清楚.本研究证明,高糖可以通过线粒体凋亡途径诱导成骨细胞凋亡.Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测显示,高糖可诱导MC3T3-E1细胞凋亡.Western印迹检测发现,不同浓度D-葡萄糖（11,22,33 mmol/L）可以引起线粒体中Bax蛋白表达的增加,使Bax蛋白由细胞质中易位到线粒体,激活了线粒体凋亡途径.JC-1荧光探针检测证实,高糖处理成骨细胞后,线粒体膜电位明显降低,表明线粒体途径被激活.而细胞质中的细胞色素c、凋亡诱导因子（AIF）表达增加,细胞色素c和AIF从线粒体中释放到细胞质中,释放到细胞质中的细胞色素c使caspase-3、caspase-9剪切活化,从而激活了caspase依赖性凋亡途径.因此,线粒体凋亡途径可能是高糖诱导成骨细胞凋亡过程中一个重要的途径.     

线粒体与细胞凋亡调控

细胞凋亡是一个受到一系列相关基因严格调控的细胞死亡过程。线粒体是细胞凋亡调控的活动中心。在凋亡因子的刺激下,线粒体释放出不同促凋亡因子如细胞色素C、Smac／Diablo等,激活细胞内凋亡蛋白酶Caspase。我们发现,活化后的Caspase可以反过来作用于线粒体,引发更大量线粒体细胞色素c的释放,构成细胞色素c释放的正反馈调节机制,从而导致电子传递链的中断、膜电势的丧失、胞内ROS的升高以及线粒体产生ATP功能的完全丧失。Bcl-2家族蛋白在细胞色素C释放和细胞凋亡调控中起关键作用。     

TFAR19促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放

TFAR19基因 (TF 1cellapoptosisrelatedgene 19)是北京大学人类疾病基因中心从人白血病细胞株TF 1细胞中克隆到的凋亡相关新基因之一 (GenBank登记号AF0 1495 5 )。初步研究发现 ,该基因在细胞凋亡时高表达 ,并且表达产物具有抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡作用。但是其确切的作用机制不明。线粒体膜完整性破坏所导致促凋亡因子 (如细胞色素c等因子 )的释放是细胞凋亡关键性的控制因素。线粒体膜通透性转运孔 (PTP) ,对线粒体膜完整性具有重要的调控作用。研究了重组人TFAR19蛋白在体外条件下 ,对线粒体PTP、跨膜电位 ,以及细胞色素c释放的影响。结果表明 ,TFAR19蛋白使分离的小鼠肝线粒体PTP开放、线粒体跨膜电位下降 ,以及细胞色素c释放。TFAR19对线粒体的上述作用是通过促进PTP开放起作用的。实验结果提示 ,TFAR19对线粒体凋亡信号有正反馈放大作用 ,并进一步揭示了TFAR19促进细胞凋亡的机制     

线粒体在细胞凋亡中的变化与作用

要在各种凋亡信号的诱导下,线粒体会发生显著的结构与功能性的变化,包括各种促凋亡蛋白(如细胞色素c,凋亡诱导因子等）的释放,线粒体膜电位的丢失,电子传递链的变化,以及细胞内氧化还原状态的变化;核转录因子以线粒体为中介也参与了细胞凋亡的调控。线粒体在哺乳动物细胞凋亡中具有核心地位和作用,昆虫细胞凋亡的研究表明,线粒体与昆虫细胞凋亡也有密切的关系。线粒体在细胞凋亡中的作用可能具有普遍意义。     

实时分析UV诱导的细胞凋亡过程中Bax的转位

Bax(Bcl-2-associated X protein)是bcl-2家族中的一个很重要的促凋亡蛋白,在正常的细胞生理状态下,主要分布在细胞质,在UV等凋亡刺激因子的作用下,则从细胞质转位到线粒体从而诱导细胞色素C的释放,最终引起细胞凋亡。缺失Bax的细胞对UV诱导的细胞凋亡有抗性,因此研究Bax的特性有助于深入了解UV诱导的细胞凋亡信号转导通路的分子机制。以前的研究大都采用生化的手段,无法在活细胞上实时动态的观察Bax蛋白的变化过程。运用激光共聚焦扫描显微成像技术单细胞实时检测了UV诱导的细胞凋亡过程中Bax的动态变化过程。研究结果表明:UV诱导的细胞凋亡过程中Bax的转位大约起始于UV照射后5 h-6 h,整个转位过程持续20 min-30 min。     

利用荧光共振能量转移技术在活细胞内研究顺铂诱导的凋亡信号通路

为在活细胞内探讨顺铂诱导的凋亡通路．实验样品经顺铂处理后,应用基于荧光共振能量转移(FRET)原理设计的荧光探针pFRET-Bid和pSCAT-3来检测Bid切割和Capase-3活化的动态变化,同时,利用荧光成像在亚细胞水平对Bid转位线粒体的动力学特征进行了实时分析．结果表明：在顺铂诱导的细胞凋亡过程中,Bid切割发生在药物刺激后4～5 h, 历时(120±20) min．Bid切割活化后即从胞浆内转位到线粒体,历时(90±15) min．在凋亡后期,可以明显检测到Caspase-3 的激活．研究表明,应用FRET及荧光成像技术,可以在活细胞内实时、直观、可视地研究顺铂诱导的细胞凋亡过程,从而客观地反映了Bid、Caspase-3等蛋白质分子在该凋亡信号通路中的动态行为及时空传递特性．     

细胞凋亡中的Bcl-2家族蛋白及其BH3结构域的功能研究

凋亡相关蛋白中的Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节分子,由抗凋亡和促凋亡成员组成,这些成员之间通过相互协同作用调节了线粒体结构与功能的稳定性,从而在线粒体水平发挥着细胞凋亡的“开关”作用.抗凋亡成员大都分布于线粒体的外膜,与促凋亡成员的BH3结构域相互作用对细胞凋亡发挥抵抗作用.促凋亡成员则主要分布于细胞浆中,细胞接受死亡信号刺激后,促凋亡成员自身受到一系列的调节,如典型的Bax构象改变、BAD和Bik的磷酸化调节以及Bid和Bim的蛋白裂解效应等,使得促凋亡成员在凋亡信号的刺激下整合于线粒体外膜,最终导致线粒体通透转换孔的开放,进而释放包括细胞色素c、凋亡诱导因子、Smac等重要的凋亡因子,随后caspase被激活进而断裂重要的细胞内结构蛋白与功能分子,执行细胞凋亡.     

利用荧光探针DsRed-Mit的细胞凋亡形态学研究

D sR ed-M it是一种特异性定位于线粒体的荧光分子探针。本文重点探讨了D sR ed-M it探针在观察细胞凋亡形态学、以及凋亡过程中动态分子调控过程研究中的应用。实验结果表明,在细胞凋亡过程中应用该探针标记线粒体,能够直观地监测线粒体肿胀的形态变化,以及细胞凋亡的重要蛋白--Bax蛋白转位线粒体和细胞色素C释放的动态过程。     

细胞器与细胞凋亡

细胞凋亡是由基因控制的有序生理过程,细胞内各组分在这一过程中相互协调,组成了精细的调控系统。除细胞核外,线粒体是近年发现与凋亡密切相关的细胞器,它经多种因子诱发可以释放细胞色素c等因子参与到凋亡途径中。进一步的研究发现,在一定条件下,内质网、溶酶体等也与凋亡活动有关。这些细胞器在细胞凋亡中的作用及其机制是目前的研究热点。     

二烯丙基三硫通过线粒体依赖性途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)对多种肿瘤有抗癌作用,但机制尚不完全清楚．为探讨DATS对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响,用丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法观察细胞凋亡情况,在显微镜下计数凋亡细胞数．JC-1荧光染色观察线粒体膜电势变化．Western blot法检测细胞色素c蛋白分布,ELISA法检测caspase-3活性． 结果显示,DATS诱导HepG2细胞凋亡,用 50 μmol/L 与100 μmol/L DATS处理48 h,细胞凋亡率分别达到60.33%和93.67%,并引起HepG2细胞线粒体膜电势降低．Western blot显示,DATS能诱导胞浆细胞色素c增加,与此同时,线粒体细胞色素c减少,诱导HepG2细胞caspase-3活化．提示：DATS可通过降低线粒体膜电势,促进细胞色素c由线粒体膜释放到胞浆中,激活caspase-3途径诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡．     

HIV Vpr蛋白诱导细胞凋亡研究进展

Vpr蛋白是HIV的一个辅助蛋白,可以诱导多种细胞的凋亡。目前的研究表明Vpr蛋白引起细胞凋亡主要是通过线粒体途径实现的。Vpr蛋白通过直接而且特异地与结合在PTPC中的ANT相互作用,改变线粒体膜通透性,导致凋亡诱导因子(AIF)和细胞色素C的释放,激活Caspase、DNases等的级联反应,引起核染色质的固缩,最终引起细胞凋亡。     

凋亡诱导因子与细胞凋亡

凋亡诱导因子 (apoptosisinducefactor,AIF)是定位于线粒体膜间隙中的一种氧化还原酶 ,含有线粒体定位信号和核定位信号序列 ,具有很强的促凋亡活性 ,在类胚体成腔和胚胎早期分化过程中具有重要作用。在死亡信号或细胞胁迫的刺激下 ,线粒体通透性转变孔开放 ,释放AIF及细胞色素c至细胞质溶质中 ,具有核定位信号序列的AIF便进入细胞核内 ,引起染色质的初步凝集和DNA大规模断片化 (约 5 0kb) ,进而引发不依赖于胱冬肽酶的细胞凋亡途径 ;线粒体膜间隙释放出来的细胞色素c则可引起染色质的进一步凝集和DNA的寡核小体断片化 ,从而引发依赖于胱冬肽酶的细胞凋亡途径 ;与此同时 ,从线粒体膜间隙释放出来的AIF又可反馈放大线粒体通透性转变孔的渗透性 ,引起AIF与细胞色素c的进一步释放从而加快细胞死亡的进程。此外 ,细胞胁迫还可激活由多聚 (ADP 核糖 )聚合酶 1(PARP 1)所引发的细胞凋亡途径 ,通过AIF和细胞色素c引发细胞凋亡。最新研究结果表明 ,AIF同源线粒体关联死亡诱导者 (AIF homologousmitochondria associatedinducerofdeath ,AMID)与p5 3应答基因的编码产物 (p5 3 responsivegene 3,PRG3)均为AIF的同源蛋白质 ,可直接诱导人类细胞的凋亡。线虫的凋亡诱导因子WAH 1所诱导的细胞凋亡途径依赖于胱冬肽酶     

细胞凋亡的线粒体调控蛋白的研究进展

凋亡早期近科固定不变的标志之一就是线粒体膜通透性（MMP）的变化,这提示线粒体在凋亡过程中执行双重作用。一方面,将多种促细胞凋亡级联转导信号合于一条由MMP激活的通路;另一方面,通过释放存在于膜间隙的可溶性蛋白参与凋亡后期的分解代谢反应,最近研究发现,核转录因子能易位到线粒体膜引起MMP改变;线粒体膜间隙存在一种蛋白质Smac/DIABLO,释放后可特异性阻抑细胞凋亡蛋白抑制剂（IAPs）,进而促进胱冬肽酶活化,引发细胞凋亡,这些发现进一步阐明了MMP与细胞死亡机制的关系。     

乙肝病毒X蛋白诱导肝癌细胞凋亡的信号转导途径

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)X蛋白(HBX)与肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生具有密切的关系.HBX不但具有拮抗细胞凋亡的作用,还具有促进细胞凋亡的作用.为了进一步探讨HBX促细胞凋亡作用的分子机制,通过脂质体转染的方法将携带X基因的真核表达载体pCMVX导入H7402肝癌细胞,使乙肝病毒x基因(HBx)瞬时过量表达.流式细胞仪检测结果显示,在瞬时转染3μgpCMVX质粒后,肝癌细胞发生凋亡.为阐明HBX诱导细胞凋亡的信号转导途径,对HBX与线粒体释放细胞色素c的关系做了初步探讨.通过罗丹明123染色,经流式细胞仪分析,显示在转染HBx基因后细胞线粒体膜电位明显下降,表明HBX可促进细胞色素c从线粒体释放增加.Western印迹检测结果显示,肝癌细胞在导入HBx基因后,细胞凋亡线粒体转导途径中细胞色素c、Apaf1、procaspase3和procaspase9等的表达水平均上调.研究结果说明,HBX可通过影响线粒体凋亡途径促进肝癌细胞凋亡.     

促凋亡蛋白BAK的功能及在病毒感染中作用的研究进展

BAK蛋白从属于BCL-2家族,是细胞凋亡途径中的关键蛋白。BAK蛋白在凋亡信号的刺激下被激活,并在线粒体上集聚成簇后诱导细胞色素c等促凋亡物质释放,通过caspase级联反应放大凋亡信号,最终诱导细胞死亡。目前的BAK研究普遍用于针对癌细胞凋亡逃逸及病毒对机体细胞免疫的逃逸过程,而病毒等病原体与BAK之间的作用机制、影响胞内凋亡和炎症通路的激活以及炎性因子活化的研究较少。因此对BAK蛋白结构、功能和BAK可能介导的相关通路进行介绍,并对其在病毒感染研究中的作用进展进行了分析,以期为促凋亡蛋白BAK在病毒感染中作用的深入研究提供一些理论基础。     

心磷脂对细胞凋亡作用的研究进展

心磷脂(cardiolipin, CL)是线粒体特异的一类磷脂,它不仅可以维持线粒体的结构,还对电子传递链复合体有影响。在细胞凋亡时,心磷脂会发生一些重分布,比如线粒体内膜外小叶中心磷脂含量的增加及细胞表面心磷脂的出现。同时,凋亡刺激还可以加速心磷脂的代谢循环,使心磷脂在线粒体内的含量降低。在细胞凋亡发生时,心磷脂作为一个信号整合体,对细胞色素c (cytochrome c, CytC)、胱天蛋白酶-8 (caspase-8)和促凋亡蛋白Bid发挥着重要的协调作用。本文主要就心磷脂在细胞凋亡过程中的重要作用及其在癌症中的研究进展进行综述。