RNA干扰对MDA-MB-231细胞中CaSR基因表达的影响

目的:运用RNA干扰技术,观察siRNA表达载体在乳腺癌细胞MDA-MB-231中对CaSR基因表达的影响。方法:构建靶向CaSR基因的RNA干扰表达载体,用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,运用Real-Time荧光定量PCR,Westernblot技术分别从mRNA以及蛋白表达水平检测CaSR基因表达的变化。结果:所构建的质粒载体成功的在MDA-MB-231细胞中抑制了CaSR mRNA及其蛋白的表达。与对照组相比,psiRNA-CaSR载体对CaSR mRNA的抑制率达到65%,对CaSR蛋白抑制率约为70%。结论:实验证明所设计的shRNA片段可以有效地抑制CaSR基因的表达,为下一步研究工作奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制乳腺癌细胞BSP基因表达

目的构建抑制人日5P基因表达的RNA干扰逆转录病毒载体,筛选建立稳定抑制BSP表达的MDA-MB-231BO细胞系。方法构建靶向人BSP基因的逆转录病毒重组质粒pSilencer—BSP27、pSilencer—BSP81和pSilencer—BSP100。将其包装成病毒后感染MDA—MB-23180细胞。用RT—PCR和Western印迹检测成功感染细胞（231BO．BSP27、231BO．BSP81、231BO—BSP100细胞）BSP基因的抑制效果。结果双酶切和测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。RT—PCR和Western印迹结果显示231BO—BSP27、BO—BSP81和231BO—BSP100细胞BSP基因在mRNA水平和蛋白水平抑制效率分别为：70．8％、79．4％和30．1％：69．3％,75．2％和27．8％。结论成功构建抑制人BSP基因表达的RNAi逆转录病毒载体pSilencer．BSP27、pSilencer．BSP81和pSilencer—BSP100。获得高效稳定抑制BSP表达的231BO—BSP27、231BO．BSP81细胞系。     

靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真核转录载体pSilencer1．0-U6-FOXMI—shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量·聚合酶链反应（Real—timeqPCR）、蛋白免疫印迹法（Westemblot）分别检测FOXMl基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSileneerl．0-U6-FOXMl-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P〈0．05）,平板克隆形成显著减少（P〈0．05）,重组载体转染后显著抑制MDA—MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXMI基因对乳腺癌细胞株MDA—MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

靶向下调FOXM1 基因表达对乳腺癌MDA-MB-231 细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1 对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真 核转录载体pSilencer1.0-U6-FOXM1-shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基 偶氮唑盐(MTT) 比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量- 聚合酶链反应(Real-time qPCR)、蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测FOXM1 基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSilencer1. 0-U6-FOXM1-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P<0.05）,平板克隆形成显著减少（P<0.05）, 重组载体转染后显著抑制MDA-MB-231 细胞中FOXM1 基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXM1 基因对乳腺癌细胞 株MDA-MB-231 生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

干扰TGFβRⅠ增加乳腺癌细胞MDA-MB-231对化疗药物的敏感性

转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)与其受体(transforming growth factorβreceptor,TGFβR)结合激活下游信号通路,在肿瘤的发生发展和转移中具有重要意义,且已有迹象表明该通路可能介导肿瘤的化疗耐受.本研究构建了干扰转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor receptor typeⅠ,TGFβRⅠ)的重组质粒pRNAT-U6.1/TGFβRⅠ-sh1,发现其可在mRNA和蛋白质水平均显著下调TGFβRⅠ的表达,P0.01.后将该干扰质粒转染乳腺癌细胞MCF-7/5Fu、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453,建立了稳定的乳腺癌TGFβRⅠ干扰模型;MTS法检测上述4种细胞模型对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和紫杉醇(taxol,TAX)的敏感性.结果显示,MCF-7、MCF-7/5Fu和MDA-MB-453细胞在干扰TGFβRⅠ之后对5-FU和TAX敏感性并未发生改变;但是间质表型的MDA-MB-231细胞在干扰TGFβRⅠ之后对5-FU和TAX的敏感性显著增加.由此可见,干扰TGFβRⅠ的表达阻断TGFβ信号通路,进而显著增加间质型乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性,这为临床乳腺癌治疗提供了一定的理论依据.     

RNA干扰与植物抗病毒

RNA干扰是多种生物体内由双链RNA介导的同源mRNA降解现象,是植物体内天然的抗病毒机制。然而病毒在长期进化过程中也获得了通过编码沉默抑制蛋白来对抗植物体RNAi系统的能力。本文对RNA干扰过程、病毒编码的沉默抑制蛋白及利用干扰技术进行抗病毒基因工程研究进行简要综述。     

RNA干扰与siRNA（小干扰RNA）研究进展

RNA干扰作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具已被广泛用于基因功能的研究以及疾病的治疗。在RNA干扰技术下调基因表达的背后存在着一个复杂的蛋白质网络参与了这一功能的实现。本文对近年来RNA干扰在疾病治疗方面的进展及其机制研究方面的进展作了一些概述。     

沉默CXCL1基因抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移、侵袭的研究

为探讨CXCL1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移、侵袭作用的影响,该研究设计针对CXCL1基因的小干扰RNA,用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附测定试验分别在RNA和蛋白质水平上检测干扰效率;采用流式细胞术学技术检测细胞的周期和凋亡情况;采用transwell迁移和侵袭试验分别检测细胞的迁移及侵袭能力。结果显示,与siRNA-NC组细胞相比,siCXCL1-1、siCXCL1-2、siCXCL1-3细胞中CXCL1基因的mRNA和蛋白表达均下调,且si CXCL1-3干扰效率最高,mRNA及蛋白表达水平分别降低了75%(p<0.01)和46%(p<0.01)。细胞凋亡试验和细胞周期试验结果显示,沉默CXCL1基因后对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的凋亡和周期无明显影响,差异无统计学意义(p>0.05)。transwell小室迁移和侵袭试验显示,沉默CXCL1基因能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭能力(p<0.01)。研究成果为临床乳腺癌中以CXCL1基因为靶点的分子治疗提供了理论依据。     

高致病性PRRSVNsp2基因RNA干扰对病毒复制的影响

旨在构建针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株Nsp2基因的siRNA的表达载体,研究Nsp2基因的表达抑制对PRRSV复制的影响。设计并合成针对PRRSV TJ株Nsp2基因的3对优势小发卡RNA(shRNA),连接到pRNAT-U6.1/Neo,构建shRNA表达载体,将鉴定正确的载体质粒转染Marc-145细胞,6 h后接毒,每日观察CPE;在接毒PRRSV TJ株后不同时间点取上清样品,测定样品TCID50;并以β-actin为内参,RT-PCR对PRRSV Nsp2 mRNA进行半定量。结果表明,选取的3条Nsp2基因的优势siRNA均能够抑制PRRSV TJ株在Marc-145细胞上增殖,其中shRNA载体S-1和S-2抑制效果明显,与空载体相比较差异极显著。本研究构建的PRRSV Nsp2基因特异性shRNA载体能够有效抑制PRRSV的复制,可使病毒滴度TCID50最多降低103.38。     

RNA干扰对Smad7基因的抑制作用

小分子干扰RNA(siRNAs)可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达,促进同源mRNA降解,称为RNA干扰(RNAi)。本研究旨在探讨Smad7基因的siRNAs是否能抑制基因的表达。利用RNA干扰技术,设计并合成了针对Smad7基因的siRNAs,用脂质体转染法瞬时转染BEP2D和BERP35T2细胞,用Northern blot法检测RNAi效应;同时设计并合成了绿色荧光蛋白(GFP)的siRNAs,瞬时转染稳定表达绿色荧光蛋白的BERP35T2细胞,检测荧光强度有无改变。结果表明RNA干扰技术能明显抑制Smad7基因的表达,并能显减弱绿色荧光的表达强度,为进一步研究Smad7基因功能及TGF-β信号转导通路奠定了基础。     

亲骨转移乳腺癌细胞MDA-MB-231BO成瘤性的初步研究

目的通过比较亲骨转移乳腺癌细胞（MDA-MB-231BO）和亲代乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的生长曲线和致瘤性,初步探讨MDA-MB-231BO细胞的生物学特性。方法MTT法测定两种细胞的生长曲线,并将两种乳腺癌细胞接种于裸鼠腋窝处皮下,建立乳腺癌细胞异种移植瘤动物模型,30 d后处死裸鼠,肿瘤组织及相关脏器官做病理检查。结果MTT法测得MDA-MB-231BO细胞生长速率高于MDA-MB-231细胞。接种两种乳腺癌细胞的裸鼠均长出肿瘤,成瘤率为100%。病理检查符合人乳腺癌细胞特征,MDA-MB-231BO组瘤体体积明显大于MDA-MB-231组（P〈0.05）。结论MDA-MB-231BO细胞生长速率高于MDA-MB-231细胞,而且MDA-MB-231BO在裸鼠体内的致瘤性强于MDA-MB-231。     

瑞戈非尼抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的研究

目的:利用裸鼠皮下成瘤动物模型及裸鼠肝脏原位多发与弥散模型,探索新型分子靶向药物瑞戈非尼对三阴性乳腺癌MDA-MB-231增殖的抑制作用,确定其分子机制。方法:培养获得人高侵袭性三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,经BALB/c裸鼠皮下注射形成皮下肿瘤,或经肝门静脉注射形成肝脏多发、弥散的肿瘤模型。给予瑞戈非尼灌胃给药治疗,3周后解剖,测量肿瘤体积并称重;或进行PET/CT检测,对核素强度、散发肿瘤占肝脏面积进行定量。通过定量PCR(q PCR)实验验证上皮-间质转化标志物与转移、侵袭相关标志物的表达水平。结果:在裸鼠皮下成瘤模型以及裸鼠肝脏原位多发与弥散肿瘤模型中,瑞戈非尼隔日灌胃给药持续3周能够显著抑制MDA-MB-231的增殖;皮下肿瘤体积、重量,以及裸鼠肝脏PET/CT检测显示瑞戈非尼持续给药组的相对核素强度均明显低于对照组;q PCR实验反映出瑞戈非尼能够抑制MDA-MB-231的上皮-间质转化与转移、侵袭作用。结论:揭示了瑞戈非尼对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖抑制作用,初步探索了其分子机制,为瑞戈非尼应用于三阴性乳腺癌的治疗提供参考。     

磺化壳聚糖对MCF-7的体外抑制作用研究

目的:研究磺化壳聚糖(SCTS)对体外培养的人乳腺癌细胞的增殖抑制和凋亡的作用.方法:用不同浓度磺化壳聚糖对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7进行干预,MTT法检测SCTS对MCF-7细胞增殖的抑制作用;显微荧光法、流式细胞术检测细胞凋亡.结果:磺化壳聚糖抑制MCF-7细胞增殖,且呈时间、剂量依赖性;镜下可见凋亡细胞的形态学改变、FCM显示G0/G1期细胞增加,而S期细胞减少.结论:磺化壳聚糖可有效抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖,促进细胞凋亡.     

色胺酮对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨色胺酮(Tryptanthrin,Try)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法:利用MTT方法检测Try(1.56-100μmol/L)对细胞增殖的影响;透射电镜观察细胞的形态学改变;流式细胞术检测细胞周期、凋亡情况及线粒体跨膜电位等指标。结果:MTT结果显示,Try在12.5-100μmol/L浓度范围内能明显抑制MCF-7细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性;透射电镜下可见Try作用48h后,MCF-7细胞有典型的凋亡样改变。Annexin V-FITC与PI双染,流式细胞仪检测结果显示:50、100μmol/LTry作用后,细胞的凋亡情况明显,与对照组相比差异显著;且影响了MCF-7的细胞周期分布,将细胞阻滞于G1期,抑制其DNA的合成;并导致细胞线粒体跨膜电位下降。结论:色胺酮能明显抑制MCF-7细胞增殖并具有诱导细胞发生凋亡的作用。     

二十二碳六烯酸增强MDA-MB-231细胞对5-FU敏感性的研究

目的:探讨二十二碳六烯酸(DHA)对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的作用及对Wnt/1β-Catenin信号传导通路的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT),测定DHA对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR检测MDA-MB-231细胞β-catenin、GSK-3β基因的表达情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞3-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表达情况;细胞免疫组化染色观察DHA及DHA联合Licl对3-Catenin蛋白细胞内表达及定位的影响.结果:20 μg/ml、40μg/ml的DHA分别与5-FU联合应用,可增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用.DHA(20 μg/ml)能促进5-FU增强MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞作用、降低细胞增殖指数及诱导细胞的凋亡.DHA作用于MDA-MB-231细胞后,β-catenin基因及蛋白表达水平下降(P＜0.05)、GSK-3β的基因及蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平下降(P＜o.05).结论:DHA能增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡,起化疗增敏作用,可能与其通过抑制GSK-3β磷酸化来阻断Wnt/β-Catenin信号通路有关.     

Biochemical Constitution of Extracellular Medium is Critical for Control of Human Breast Cancer MDA-MB-231 Cell Motility

Although voltage-gated sodium channel (VGSC) activity, upregulated significantly in strongly metastatic human breast cancer cells, has been found to potentiate a variety of in vitro metastatic cell behaviors, the mechanism(s) regulating channel expression/activity is not clear. As a step toward identifying possible serum factors that might be responsible for this, we tested whether medium in which fetal bovine serum (FBS) was substituted with a commercial serum replacement agent (SR-2), comprising insulin and bovine serum albumin, would influence the VGSC-dependent in vitro metastatic cell behaviors. Human breast cancer MDA-MB-231 cells were used as a model. Measurements of lateral motility, transverse migration and adhesion showed consistently that the channel's involvement in metastatic cell behaviors depended on the extracellular biochemical conditions. In normal medium (5% FBS), tetrodotoxin (TTX), a highly specific blocker of VGSCs, suppressed these cellular behaviors, as reported before. In contrast, in SR-2 medium, TTX had opposite effects. However, blocking endogenous insulin/insulin-like growth factor receptor signaling with AG1024 eliminated or reversed the anomalous effects of TTX. Insulin added to serum-free medium increased migration, and TTX increased it further. In conclusion, (1) the biochemical constitution of the extracellular medium had a significant impact upon breast cancer cells' in vitro metastatic behaviors and (2) insulin, in particular, controlled the mode of the functional association between cells' VGSC activity and metastatic machinery.     

蛋白表达抑制稳定株MDA—MB-231-Tudor—SNI的筛选和鉴定

目的采用针对人类Tudor—SN基因的RNA干扰（RNAi）技术建立Tudor—SN表达抑制的乳腺癌MDA—MB-231稳定细胞株。方法利用脂质体转染方法将pGenesil—shRNA—hTudor—SNI质粒转染进入MDA—MB-231细胞,经G418筛选出稳定株,通过RT—PCR检测Tudor—SN的mRNA水平,再以Western印迹技术鉴定Tudor—SN蛋白表达情况并计算蛋白表达抑制率。结果与对照组相比,以G418筛选的MDA—MB-231-Tudor—SNI稳定株Tudor—SN的mRNA水平降低（P〈0．01,n=3）,蛋白表达水平明显下调（P〈0．01,n=3）,蛋白表达抑制率达78．12％。结论成功筛选并鉴定人类Tudor—SN蛋白表达抑制MDA—MB-231稳定株,有助于深入研究Tudor—SN蛋白在乳腺癌中的作用。