高山美利奴羊INHA基因多态性生物信息学分析及与产羔数关联分析

本研究旨在研究高山美利奴羊INHA基因外显子多态性及其与产羔数的相关性。本实验通过比对高山美利奴羊全基因组测序结果中不同个体INHA外显子,分析高山美利奴羊INHA基因的单核苷酸多态性,应用生物信息学软件分析高山美利奴羊INHA基因突变前后不同等位基因的m RNA二级结构、蛋白质的二级结构及三级结构。通过上述分析,将引起高山美利奴羊INHA编码氨基酸变化的位点作为该基因的特异性候选位点,通过直接测序法分析高山美利奴羊特异性候选位点INHA基因多态性,并分析其与产羔数的相关性。结果发现,高山美利奴羊INHA基因外显子区域存在3个SNPs,分别为T206A (Met→Lys)、T387A(Thr→Thr)、G900A (Pro→Pro);INHA基因3个SNPS都改变了RNA的最小自由能以及二级结构,错义突变T206A (Met→Lys)引起蛋白质二级结构和三级结构的改变;高山美利奴羊INHA基因T206A突变表现出3种基因型分别命名为TT、TA、AA,基因型与产羔数关联分析发现TT、TA基因型个体的产羔数极显著高于TT基因型个体(p<0.01)。本研究初步表明INHA基因是影响高山美利奴羊产羔数的一个主效基因。     

山东地方山羊BMP15基因多态性与产羔数性状关联分析

利用PCR、克隆测序、序列拼接获得山羊(Capra hircus)BMP15基因全长。利用F-CSGE技术分析两个外显子,发现山羊BMP15编码序列的第901处发生了A→G单碱基突变,该突变使得第301位氨基酸(成熟蛋白质第32位氨基酸)由丝氨酸变为甘氨酸。利用LDR技术对济宁青山羊、鲁北白山羊和沂蒙黑山羊进行突变检测,并进行其与产羔数的关联分析。结果表明,该突变对济宁青山羊产羔数没有显著影响,但对鲁北白山羊及沂蒙黑山羊产羔数均有显著影响(P0.05)。GG型和AG型的鲁北白山羊产羔数分别比AA型多0.34只(P0.01)和0.31只(P0.01)。AG型沂蒙黑山羊的产羔数比AA型多0.13只(P0.01)。初步表明,BMP15是控制鲁北白山羊和沂蒙黑山羊多胎性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。     

波尔山羊9个微卫星标记与产羔性状的关联研究

选择与绵羊高繁殖力主效基因FecB和FecX紧密连锁的5个微卫星标记BM1329, BM143, OarHH55, TGLA68和LSCV043, 和其他4个微卫星标记ETH225, INRA063, BM1225和MAF0214, 分析研究其与波尔山羊产羔数的关联。结果表明: 所研究的9个波尔山羊微卫星基因座均为高度多态性基因座(PIC > 0.5)。找到与波尔山羊产羔性状显著相关的等位基因计12个。其中与波尔山羊第一胎产羔数有显著正效应的等位基因3个: BM143的120 bp和108 bp, ETH225的183 bp; 与波尔山羊第一胎产羔数有显著负效应的等位基因8个: BM1329的216 bp、BM143的110 bp、BM1225的255 bp和239 bp、INRA063的175 bp、177 bp和189 bp, ETH225的163 bp。与波尔山羊第二胎产羔数有显著正效应的等位基因1个: TGLA68的115 bp。     

FTH1基因多态性与湖羊和小尾寒羊产羔数的关联分析

为了解FTH1基因在2个绵羊品种中的遗传变异及其与产羔数的关系,本研究以具有详细产羔记录的湖羊(n=424)和小尾寒羊(n=432)为研究对象,采用DNA-pooling结合PCR-RFLP的方法进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)扫描,同时分析SNP位点与绵羊产羔数的相关性。结果表明,在FTH1基因第一内含子上发现一个g.1635GA的SNP位点,并在小尾寒羊和湖羊群体中均有AA、AG和GG三种基因型,其基因型频率分别为0.08、0.45、0.47和0.10、0.43、0.47,A和G等位基因频率分别为0.305、0.695和0.315、0.685,表明GG为优势基因型,G为优势等位基因;湖羊群体的基因He、Ho、Ne和PIC分别为0.431、0.569、1.759和0.338;在小尾寒羊中则分别为0.424、0.576、1.737和0.334。χ~2适合性检验表明,在此位点湖羊和小尾寒羊群体均不处于Hardy-Weinberg平衡状态(p0.05)。与产羔数的关联分析发现,在湖羊群体中,GG基因型个体的产羔数显著高于AA基因型(p=0.029),而在小尾寒羊群体中各基因型个体的产羔数差异不显著。综上所述,FTH1基因可以作为提高湖羊产羔数的分子辅助标记。     

绵羊ESR2基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

为了探究雌激素受体2 (Estrogen receptor 2, ESR2)基因在绵羊各组织的表达及其多态性与产羔数之间的关系,本研究利用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术检测ESR2基因在不同繁殖力小尾寒羊群体组织中的相对表达量,同时采用Sequenom MassARRAY誖SNP技术对多羔品种绵羊(小尾寒羊,湖羊,策勒黑羊)和单羔品种绵羊(苏尼特羊,草原型藏羊,滩羊) ESR2基因g.73324006C>T位点进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。半定量PCR表明,ESR2基因在单、多羔小尾寒羊子宫中高表达,在其它组织中等或低丰度表达;单羔群体、多羔群体间荧光定量PCR表明,ESR2基因在单羔小尾寒羊垂体表达量显著高于多羔小尾寒羊(p<0.05);群体遗传学分析表明,g.73324006C>T在小尾寒羊群体中表现为低度多态(PIC<0.25),在滩羊群体中处于中度多态(0.25T在小尾寒羊群体处于哈代温伯格平衡状态(p>0.05);关联分析表明,g.73324006C>T位点多态性与小尾寒羊第一胎、第二胎、第三胎产羔数及平均产羔数均显著关联(p<0.05),CC型各胎产羔数均高于TC型。与FecB (A746G)基因组合后发现,GG-CC和AG-CC基因型母羊产羔数显著高于AA-TC、AA-CC、AG-TC基因型组合(p<0.05)。综上,ESR2与小尾寒羊产羔数密切相关,g.73324006C>T可作为绵羊产羔性状选育的潜在分子标记。     

水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因外显子1多态性分析

为了揭示牛科物种INHA基因的遗传特征,该文采用PCR产物直接测序法对水牛、大额牛和牦牛INHA基因外显子1及其侧翼序列进行多态性检测,并结合已发表的包括牛科物种在内的一些哺乳动物数据进行了比较分析。结果表明,在水牛INHA基因外显子1中存在c.73C>A替换,为同义替换,河流型和沼泽型水牛编码产物一致;在大额牛的INHA基因外显子1中发现c.62C>T、c.187G>A替换,分别引起INHA中氨基酸发生p.P21L、p.V63M改变,两者均为相同性质氨基酸的替换;在牦牛中发现c.62C>T、c.129A>G替换,前者也引起编码氨基酸发生p.P21L替换,后者为同义替换。在INHA基因5’侧翼区所测出的序列中,水牛、大额牛和牦牛等物种内均未发现SNP位点,但在种间发现存在c.-6T>G的替换,大额牛、牦牛和普通牛均为c.-6G,而水牛为c.-6T。在INHA基因内含子中,水牛的第31～36位核苷酸处发现有6个碱基的缺失,即c.262+31₂62+36delTCTGAC;该位点在河流型水牛中野生型（+/+）占主体,而在沼泽型水牛中则缺失型（-/-）占主体。在大额牛、牦牛和普通牛等其它牛科物种的内含子中均未发现该缺失,但与水牛相比,大额牛、牦牛和普通牛内含子中发现缺失c.262+78₂62+79delTG。序列比对显示,INHA基因外显子1序列中c.43A和c.67G为水牛中所特有,而c.173A和c.255G为大额牛、牦牛和普通牛所共有,c.24C、c.47G、c.174T和c.206T为山羊所特有。大额牛、牦牛和普通牛间INHA基因外显子1序列差异较小,而山羊和水牛与它们间的差异相对较大。     

蒙古山羊和哈萨克山羊GOLA-DRB3基因的HaeⅢ酶切多态性分析

采用限制性内切核酸酶HaeⅢ对蒙古山羊和哈萨克山羊GOLA-DRB3基因外显子2的285bp扩增产物进行了PCR-RFLP多态性分析,共检测到17种基因型,由A、B、C、D、E、F和H等7个复等位基因控制;通过酶切图谱分析发现蒙古山羊和哈萨克山羊的GOLA-DRB3基因外显子2的154、168和220位碱基表现出多态性。并对基因型频率和等位基因频率进行了统计分析,结果表明,GOLA-DRB3基因的部分基因型频率和等位基因频率在两个群体之间差异显著（P＜0.10或P＜0.05）或极显著（P＜0.01）; χ2适合性检验结果表明,蒙古山羊和哈萨克山羊的GOLA-DRB3基因外显子2的HaeⅢ酶切位点均未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.01）。 Abstract:The exon2 of GOLA-DRB3 gene was amplified and a uniform fragment of 285bp was obtained in Mongolian Goat and Kazakh Goat.The 285bp PCR product was digested with restriction endomuclease HaeⅢ and genetic polymorphism was investigated by PCR-RFLP.Seventeen kinds of genotypes were found in two populations,which were controlled by seven alleles.There are significant differences in some genotypic frequencies and gene frequencies between the two populations（P＜0.10,P＜0.05,P＜0.01）;The results of χ2 test showed that genotypes of GOLA-DRB3 gene in two populations did not fit with Hardy-Weinberg equilibrium（P＜0.01）.     

生长激素基因多态性与山羊体重性状的关系

以鲁北白山羊、波尔山羊以及波尔山羊与鲁北白山羊的杂交一代、回交一代共计224只山羊为材料,根据山羊生长激素基因5′调控区的序列(GenBank登录号:D00476)设计两对引物,用PCRSSCP法进行多态性分析。多态性片段的纯合基因型经克隆测序,发现共有5处突变。对突变位点产生的不同基因型与体重、体尺性状进行分析表明:第一对引物扩增片段波尔山羊AA型个体的初生重、周岁重显著高于BB型和AB型(P<0.05);杂交一代中断奶重、周岁重也以AA型偏高,但不同基因型间的差异均不显著(P>0.05);而鲁北白山羊BB基因型的体重相对于另外两种基因型的偏低,且断奶重的差异达到显著水平(P<0.05)。第二对引物扩增片段不同基因型对体重、体尺没有显著影响。由此初步推断生长激素基因可能是影响山羊体重性状的主基因或与主基因相连锁,可以用该位点对山羊体重性状进行标记辅助选择。     

乐至黑山羊PRLR基因外显子10多态性与产羔数的关系研究

设计2对特异性引物对乐至黑山羊PRLR基因第10外显子进行了PCR-SSCP检测,并研究该基因与产子性能的相关性。结果表明,P1引物扩增片段不存在多态性;P2引物扩增片段存在多态性,表现为AA,AB,AD和CD 4种基因型,测序结果表明,4种基因型都在该片段第89、94、146和157位存在C→T、A→C、C→G、G→C的突变;此外AA型还在61位发生C→T的突变;AD型还在175位发生A→G的突变;CD型还在24位发生T→C的突变,96位发生C→T的突变,通过统计分析发现AD型平均产羔数优于其他3种基因型,并且与AB型差异达到显著水平(P<0.05)。因此认为PRLR基因对于乐至黑山羊产子性能有一定的影响。     

FecB基因在9个绵羊品种中的多态性及其与产羔数和羔羊生长发育的相关性

以绵羊BMPR-IB基因为候选基因,应用PCR-RFLP方法通过分析湖羊、夏洛来、陶赛特、萨福克、罗米丽、中国美利奴羊、中国美利奴肉用多胎品系以及陶赛特×中国美利奴羊和萨福克×中国美利奴羊杂交后代共615只个体的FecB基因多态性,以及BMPR-IB基因多态性对产羔数、体尺和体重的影响.结果表明,BMPR-IB基因在不同品种(系)绵羊中共有3种基因型(BB、B+和++),但基因型频率分布在各品种(系)间差异极显著(P<0.01).在湖羊中仅有BB基因型;在中国美利奴肉用多胎品系中BB、B+和++基因型频率分别为51%、30%和19%;而其他品种(系)羊中则仅有++基因型.对中国美利奴羊肉用多胎品系研究,发现BB和B+基因型群体平均产羔数分别为2.8和2.3,显著高于++基因型群体(1.2,P<0.01).在90日龄时,BB和B+基因型群体的体重分别为18.6±3.70 kg和18.0±3.31 kg,显著高于++基因型群体(15.6±2.22kg,P<0.05);此外,90日龄时,BB和B+基因型群体比++基因型群体胸围、胸宽较大(P<0.05);但这些差异在120日龄时消失.另外,我们还发现不同地区群体的第一胎产羔数存在明显差别.这些结果表明,BMPR-IB基因为影响绵羊产羔数的主效基因,并首次证明该基因对后代羔羊出生后生长发育具有加性效应.     

5个山羊品种CSN1S2基因的Alw26Ⅰ酶切多态性分析

利用PCR RFLP技术对西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊5个品种的170个个体的αs2酪蛋白(CSN1S2)基因进行多态性分析,结果表明:扩增大小为310bp的片段经限制性内切酶Alw26Ⅰ酶切后表现多态,且5个山羊品种该基因座位均处于Hardy Weinberg平衡状态。西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊的基因杂合度/有效等位基因数/Shaanon信息熵/PIC值分别为0.1589/1.1889/0.2955/0.1463,0.4114/1.6981/0.6017/0.5171,0.1653/1.1980/0.3046/0.1516,0.0646/1.0691/0.1463/0.0625,0.0541/1.0572/0.1270/0.0526。分析结果显示,关中奶山羊的遗传多样性最丰富,表现为高度多态;其次是西农萨能奶山羊和陕南白山羊,而安哥拉山羊和波尔山羊的遗传变异程度最低。     

5个山羊品种CSN1S2基因的A/W26Ⅰ酶切多态性分析

利用PCR-RFLP技术对西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊5个品种的170个个体的αs2酪蛋白(CSN1S2)基因进行多态性分析,结果表明:扩增大小为310 bp的片段经限制性内切酶Alw26Ⅰ酶切后表现多态,且5个山羊品种该基因座位均处于Hardy-Weinberg平衡状态.西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊的基因杂合度/有效等位基因数/Shaanon信息熵/PIC值分别为0.1589/1.1889/0.2955/0 1463,0.4114/1.6981/0.6017/0.5171,0 1653/1.1980/0 3046/0.1516,0 0646/1.0691/0.1463/0.0625,0 0541/1.0572/0.1270/0.0526.分析结果显示,关中奶山羊的遗传多样性最丰富,表现为高度多态;其次是西农萨能奶山羊和陕南白山羊,而安哥拉山羊和波尔山羊的遗传变异程度最低.     

黑白花牛INHA基因多态性与超数排卵性状关系

为了研究黑白花牛抑制素α基因(INHA)的遗传多样性和超数排卵效果的关联分析,找到一种能够作为黑白花牛超数排卵预测的候选基因,本试验以50头黑白花牛为实验材料,对其进行了超排处理并且采集了黑白花牛的血液样本提取基因组。采用PCR-SSCP技术,在INHA基因的第一外显子和第二外显子各设计了一对引物进行基因型检测,然后与超排性状进行关联分析。结果表明:黑白花牛INHA基因的177 bp处(+1为转录起始位点)存在一个A>G突变的多态性位点,AA和AG基因型的频率分别为0.62和0.38。与超排性状关联分析,结果显示AG基因型黑白花牛的排卵数和鲜胚数均显著多于AA基因型(p<0.05),这说明黑白花牛个体的超排性状可能与其本身的INHA基因的遗传特性有关。     

北京黑猪FSHb 亚基基因的多态性与繁殖性状的关联分析

本研究以北京黑猪为研究对象, 以FSHb 亚基基因为产仔性状的候选基因, 分别采用PCR产物直接电泳和PCR-RFLP方法来检测FSHβ亚基基因2个位点的多态性。结合测序发现: FSHb-1位点上, 北京黑猪BB型的134与135 bp (D00621序列的6 473与6 474 bp) 之间插入273 bp的片段而产生多态, 序列分析表明该插入片段为一典型的逆转座子, 在插入片段中还发现了一个RNA 聚合酶Ⅲ内部启动子; FSHb-2位点上, 由于扩增片段173 bp处存在C→T的突变, 使得HaeⅢ酶切位点消失而产生多态; 2个位点的A、B等位基因在北京黑猪群体中都有分布, 且处于低度多态。χ2适合性检验结果表明, 该群体在这2个位点的突变都达到Hardy-Weinberg平衡状态 (P>0.05)。用SAS 8.2 软件最小二乘法拟合线性模型, 将基因座不同基因型与繁殖性状总产仔数 (TNB)、产活仔数 (NBA) 和出生重 (WB) 进行了关联分析, 结果表明: 就初产母猪而言, FSHb-1位点上, AA型比AB和BB型个体的TNB分别多0.96头和1.85头 (P＜0.05), AA和AB型比BB型个体的NBA分别多0.95头和1.69头(P＜0.05)。FSHb-2位点上, AA型比AB型和BB型个体的TNB分别多1.57头和2.15头 (P＜0.05); AA和AB型比BB型个体的NBA分别多1.00头和0.94头 (P＜0.05); 就经产母猪而言, FSHb-2位点上, AA型个体的WB比BB型的WB重0.25 kg (P＜0.05)。全部群体的FSHb-1位点的A等位基因和初产母猪FSHb-2位点的A等位基因对TNB、NBA和WB表现为正效应。     

微卫星标记OarHH35,OarHH55和BM1329与乐至黑山羊产羔数相关性研究

根据微卫星标记在相近物种中具有高度保守性的特点,采用比较基因组学方法,初步探讨了3个与绵羊、山羊产羔率紧密相关的微卫星标记OarHH35、OarHH55和BM1329在4代85只乐至黑山羊中与其产羔数的相关性.结果显示微卫星标记BM1329在乐至黑山羊中可检测到的等位基因数为3,其片段大小分别为125、147和300 bp;标记OarHH55可检测到的等位基因数为2,片段大小分别为106和181 bp;标记OarHH35可检测到的等位基因数为3,片段大小分别为88、112和175 bp.统计分析表明,BM1329的300 bp等位基因和OarHH35的112 bp等位基因对乐至黑山羊产羔数呈正效应(P<0.05),而BM1329的147 bp等位基因和OarHH35的175 bp等位基因对产羔数呈负效应(P<0.05).因此,微卫星标记OarHH35和BM1329可作为乐至黑山羊高繁殖性能候选标记进行深入研究.     

山羊MyoD基因家族多态性及与体尺性状的相关性

用PCR-SSCP技术研究了波尔山羊和徐淮山羊2个群体共147个个体MyoD基因家族中3个基因座位的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。结果表明, 在徐淮白山羊群体中, myf-5基因座发现有3种基因型AA、AB和BB, 波尔山羊均为AA型。在myf-6基因座和myoD 5′侧翼区基因座, 两个山羊群体均检测到了AA和AB型个体。对山羊myf-5、myf-6基因座, myoD 5′侧翼区基因座不同基因型与两品种山羊体尺性状相关分析表明, myf-5基因座对管围和管围指数的效应差异显著(P<0.05)。myf-6基因座对徐淮白山羊体尺性状的效应均不显著(P>0.05), 而对波尔山羊的体高和管围指数效应差异显著(P<0.05)。两个山羊品种myoD 5′侧翼区不同基因型个体的体尺性状差异均不显著。     

山羊生长激素基因5′调控区的多态性分析

以鲁北白山羊、引进波尔山羊、纯繁波尔山羊以及鲁北白山羊与波尔山羊的杂交一代、回交一代共计274个个体为研究材料,用两对引物分别扩增山羊生长激素(GH)基因5′区的26～239bp以及225～429bp片段,扩增产物经SSCP分析发现均存在多态性.在26～239bp片段上,波尔山羊及杂交后代以AA型个体占多数,而鲁北白山羊则BB型个体较多;在225～429bp片段上,所有种群均以CC型个体较多.对两个片段的纯合型(AA,BB;CC,DD)分别克隆测序发现:(1)26～239bp片段上AA型在第60位发生了C→T的突变,第211位发生碱基C的丢失,(2)225～429bp片段上,DD型存在3处突变,分别为264位由T→C,292位由T→A,372位由C→T.上述结果为首次实验证实山羊生长激素5′调控区存在序列多态性.     

北京黑猪FSHβ亚基基因的多态性与繁殖性状的关联分析

本研究以北京黑猪为研究对象,以FSHβ亚基基因为产仔性状的候选基因,分别采用PCR产物直接电泳和PCR-RFLP方法来检测FSHβ亚基基因2个位点的多态性.结合测序发现:FSHβ-1位点上,北京黑猪BB型的134与135 bp(D00621序列的6473与6474bp)之间插入273 bp的片段而产生多态,序列分析表明该插入片段为一典型的逆转座子,在插入片段中还发现了一个RNA聚合酶Ⅲ内部启动子;FSHβ-2位点上,由于扩增片段173 bp处存在C→T的突变,使得HaeⅢ酶切位点消失而产生多态;2个位点的A、B等位基因在北京黑猪群体中都有分布,且处于低度多态.x2适合性检验结果表明,该群体在这2个位点的突变都达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05).用SAS 8.2软件最小二乘法拟合线性模型,将基因座不同基因型与繁殖性状总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)和出生重(WB)进行了关联分析,结果表明:就初产母猪而言,FSHβ-1位点上,AA型比AB和BB型个体的TNB分别多0.96头和1.85头(P＜0.05),AA和AB型比BB型个体的NBA分别多0.95头和1.69头(P＜0.05).FSHβ-2位点上,AA型比AB型和BB型个体的TNB分别多1.57头和2.15头(P＜0.05);AA和AB型比BB型个体的NBA分别多1.00头和0.94头(P＜0.05);就经产母猪而言,FSHβ-2位点上,AA型个体的WB比BB型的WB重0.25 kg(P＜0.05).全部群体的FSHβ-1位点的A等位基因和初产母猪FSHβ-2位点的A等位基因对TNB、NBA和WB表现为正效应.