斜纹夜蛾泛素基因的克隆及表达

泛素介导的蛋白质降解途径对脑内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对简并引物,从斜纹夜娥(Spodoptera litura)细胞中克隆了泛素基因的编码区,CenBank登录号AF436066。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8．56kD的蛋白,其等电点为6．56。同源性比较发现,斜纹夜峨泛素基因不仅与其它真核生物的泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性,而且与斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltMNPV)泛素基因的同源性为84％。RT—PCR分析发现,泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织,尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB,在大肠杆菌M15中诱导并高效表达出了带有His—tag的重组融合蛋白,薄层扫描分析得知靶蛋白约占总蛋白的37％。利用Ni—NTA亲和层析胶纯化得到重组融合蛋白,经SDS—PAGE鉴定为单一区带,为进一步研究S．litura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。     

SINPV基因组酶切图谱及多角体基因的序列分析

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＸａｂＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｄｎⅢ、ＳｍａＩ酶解斜纹夜蛾核多角体病毒广州株基因组ＤＮＡ,分别得到２６、２６、２４、２０、１３、１７、９、１条片段,并算得基因组平均大小为１３６．０ｋｂｐ。以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分读码框为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交将ＳＩＮＰＶ多角体基因定位于ＸｂａＩＯ片段上。将此片段克隆并序列分析,结果表明ＳＩ     

桑蚕金属硫蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用\%Bam\%HⅠ和\%Sac\%Ⅰ双酶切质粒pCM1\|1,获得酵母的MTI基因片段,用非放射性地高辛标记作为探针。提取桑蚕肥苏蚕卵的总DNA,分别用\%Eco\%RⅠ、\%Bam\%HⅠ和\%Hin\%dⅢ酶切,与MTI探针进行Southern杂交,出现较强的杂交信号。然后用\%Eco\%RⅠ完全酶切桑吞的总DNA,电洗脱法回收1～6kb的染色体片断,与\%Eco\%RⅠ酶切的M13-载体以3∶1比例连接,转化受体菌DH5α。筛选到4 000多个白色转化子,与探针MTI进行Southern杂交筛选阳性转化子,选择到有强杂交信号的三个转化子［编号为T1(pZHC\|1)\,T5(pZHC\|5)\,T7(pZHC\|7)\]。用12种限制性内切酶对pZHC\|5重组质粒进行酶切分析表明插入片段约12kb,在基因内有一个\%Hin\%dⅢ位点。抗性测定表明受体菌DH5α在含有50mmol/L CuSO\-4的培养基上生长,在含有52mmol/L CuSO\-4的培养基上不生长,而转化子确能在含有52mmol/L CuSO\-4以上的培养基上生长。上述研究结果表明12kb左右的插入片段含有桑吞的金属硫蛋白基因。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

虹鳟spindlin基因克隆及不同倍性的表达分析

spindlin基因是减数分裂纺锤体相关因子,为了研究spindlin基因在二倍体和三倍体雌性虹鳟减数分裂过程中出现的差异,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得spindlin基因cDNA 4529 bp(GenBank登录号:MN378564),其中3′非编码区(UTR)和5′非编码区(UTR)分别长3662 bp和141 bp,开放阅读框(ORF)长726 bp,编码241个氨基酸,该蛋白质序列的相对分子量为28.3 kD,理论等电点值为5.94,无跨膜结构。同源性分析表明,虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,高达99.59%。系统发育进化树显示,虹鳟与大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和红点鲑(Salvelinus alpinus),聚为一支。实时荧光定量(RT-PCR)结果显示, spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠和鳍组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。对于二倍体雌性虹鳟,在受精后24...     

马氏珠母贝Sox11基因的克隆及时序表达模式分析

为探究Sox(SRY-related HMG-box genes)基因家族在马氏珠母贝个体发育及性别分化中的作用, 研究首先利用兼并引物从马氏珠母贝基因组中克隆到一个HMG框(high mobility group box), 利用RACE-PCR技术从SMART cDNA文库中克隆到一个Sox基因的cDNA全长, 通过Clustal X和MEGA 4软件对该序列进行比对分析并构建系统进化树; 通过荧光定量PCR技术对该基因在不同组织及发育不同时期性腺中的表达情况进行分析。结果显示, 马氏珠母贝该Sox基因的cDNA全长为1579 bp, 其中开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸, 5'非编码区为126 bp, 3'非编码区为445 bp。同源性分析表明, 马氏珠母贝Sox基因与太平洋牡蛎Sox11基因的同源性(Identity)最高, 为80%, 故命名为pmSox11; 系统进化树分析也显示pmSox11与太平洋牡蛎Sox11基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析组织表达特异性显示, pmSox11在马氏珠母贝神经节分布较多的组织如外套膜、鳃、足、消化盲囊等大量表达, 在神经节相对较少的闭壳肌和卵巢中表达量较少; 时序表达图谱显示, pmSox11在3月龄幼贝性腺和1年龄发育早期精巢中表达量最高, 在2年龄成熟精巢和2年龄性转换性腺中表达量降低, 而在2年龄卵巢中表达量最低。研究表明, pmSox11基因可能在马氏珠母贝早期神经系统发育和性别发育的调控方面起到重要作用。     

THE CLONING, SEQUENCING AND EXPRESSION OF THE LdMNPV POLYHEDRIN GENE

Abstract  LdMNPV - NEFU isolate collected from the forestry farm of Northeast Forestry University was purified and the genomic DNA of MMNPV was extracted. The LdMNPV polyhedrin gene was cloned by PCR. The results showed that the sequence was an open reading frame (ORF) of 735bp capable of encoding 245 amino acids. The polyhedrin gene sequences of the MMNPV-NEFU isolate and a Canada strain, MMNPV-G differed in 5 bases. The polyhedrin gene of the LdMNPV-NEFU isolate contained C, G, T, C and G at 54, 109,379, 508 and 701 sites from the start codon, but the LdMNPV-G isolate contained G, C, C, T and T at the corresponding sites respectively. The same amino acids were encoded by the two ORF sequences, with the exception that Asp and His are encoded by GAC on the polyhedrin gene sequence of the LdMNPV-NEFU isolate and by CAC in the MMNPV-G isolate. The MMNPV polyhedrin gene was expressed in E. coli BL21 (DE3) by the pT7–7 plasmid vector.     

坚强芽孢杆菌三个淀粉酶基因的克隆和表达

以pUC18为载体,用鸟枪法从产淀粉水解酶的坚强芽孢杆菌725菌株中得到三个产淀粉水解酶的重组质粒,在大肠杆菌中表达。用高压液相色谱分析了三个表达的酶的淀粉水解产物,其中pBA135和pBA150表达的酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖,具β-淀粉酶的性质。pBA140表达的酶的淀粉水解主要产物除麦芽糖外还有一糖,三糖和四糖。pBA135编码的酶有较好的热稳定性,60℃保温30min,活性保留70％以上,最适反应温度55-60℃。而在同样条件下pBA150编码的酶仅保留37％的酶活,最适反应温度50℃。     

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短,降解效率高     

雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达

叶绿体或者有色体中的质体球滴结构(Plastoglobules)是多数植物的类胡萝卜素等次生代谢产物积累的场所,但在能大量积累虾青素的雨生红球藻中,这个结构一直没有得到确认。通过透射电子显微镜观察发现雨生红球藻的质体内确切存在plastoglobules结构;并通过RT-PCR结合RACE技术,从雨生红球藻cDNA文库中克隆到了与编码plastoglobules的结构蛋白(Plastoglobulin)具有高度同源性的基因序列全长,称做Hpgp基因;该基因的表达产物称之为雨生红球藻质体球滴蛋白(HPGP;Haematococcus plastoglobules pro-tein);并进一步利用原核表达系统将该编码基因进行原核诱导表达,用His-Tag蛋白分离纯化系统纯化到了目标蛋白,并用该His-Tag融合蛋白为抗原免疫实验兔,制备到了相应的一抗抗体,为下一步对该蛋白的功能阐明以及雨生红球藻的虾青素积累机制研究提供重要的基础。     

斜纹夜蛾幼虫造血器官的形态、组织及超微结构

斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius幼虫的造血器官位于翅芽部位,由发育层次不同的许多细胞岛和一些单个或成串的梭形细胞组成.各细胞岛或细胞均裹有一层非细胞性膜鞘.环绕同一翅芽的众多细胞岛和细胞相互间由其膜鞘连结成簇.膜鞘紧裹着的单个或成串梭形细胞具未分化细胞特征.发育初期的单个细胞岛体积较小,直径约20—45μm以下,岛内均为排列紧密的分化中未成形原血细胞.较发育的细胞岛体积较大,细胞间排列较松,岛内除原血细胞外,还出现少量浆血细胞、颗粒细胞和小球细胞的分化.此外,还发现一个具颗粒细胞和小球细胞特征的混合细胞类型.发育初期的细胞岛膜鞘表面结构完好.随着岛内细胞的增殖分化,膜鞘出现破裂,且破裂逐渐增大,以致完全破裂而裸露岛内细胞团,以此释放血细胞.大量血细胞释放出现于幼虫预备脱皮至下一龄幼虫初期的造血器官.各龄幼虫的各发育阶段血淋巴血细胞总数(THC)的变动与造血器官释放血细胞密切相关.     

舞毒蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆、测序和表达

从东北林业大学实验林场采集并纯化了舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV-NEFU)。用蛋白酶K消化,提取了病毒基因组DNA。用PCR方法,克隆出了该病毒的多角体蛋白（polyhedrin)基因,并对该基因进行了序列测定。结果显示,该基因序列是一个含有735个碱基对的开放阅读框（ORF）,该阅读框编码245个氨基酸。有5对碱基与加拿大病毒株LdMNPV-G的多角体蛋白基因序列存在差异。LdMNPV-NEFU分离株的多角体蛋白基因的第54,109,379,508和701位（从起始密码子中的A开始）分别是C,G,T,C和G,而LdMNPV-G分离株的多角体蛋白基因（ORF）相应位置上的碱基分别是G,C,C,T和T,两个ORF编码的对应位置的氨基酸绝大多数相同,只有一对不同,即由LdMNPV-NEFU编码的天冬氨酸和由LdMNPV-G编码的对应位置的组氨酸。以质粒pT-7-7为载体,多角体蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了原核表达。     

斧文蛤金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒、维持金属元素代谢平衡以及清除自由基等生理功能。为了解斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）的分子生物学特征及其在重金属Cd2+胁迫下的响应机制,本文采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）总RNA反转录产物中获得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。该序列包含65 bp的5非编码区（UTR）和340 bp的3非编码区（UTR）以及231 bp的开放阅读框（ORF）,可编码76个氨基酸;其中半胱氨酸占27%,不含芳香族氨基酸,含16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构,预测的分子量约为7.704 kD,理论等电点7.138。MT氨基酸序列比对分析表明:斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）与丽文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高达88%,与文蛤（Meretrix meretrix）的同源性为87%。实时荧光定量（qRT-PCR）检测MT在斧文蛤5种组织中均有表达,但存在组织特异性,其中内脏团表达量最高,其次依次为鳃丝、闭壳肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）胁迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下,斧文蛤内脏团MT呈现出不同程度的上调表达,具体表现为高-低-高-低的波浪式变化,除6h以外,其他时间点均与对照组存在极显著差异（P0.01）。本研究表明:MT基因在维护机体正常生理功能及斧文蛤抵御重金属Cd2+胁迫过程中发挥着重要的分子调控作用。     

伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株编码包膜糖蛋白gD的基因并进行了序列测定 ,与国外报道的Rice株相比 ,其核苷酸序列具有 98%的同源性 ,推导氨基酸序列同源性为 97%。将此基因克隆于具有全期启动子盒的杆状病毒转移载体pSX35A中 ,构建成重组转移质粒pSX35A gD ,与致死缺失型线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV OCC- )基因组DNA一起共转染粉纹夜蛾Hi5细胞 ,经同源重组 ,获得含gD基因的重组病毒AcMNPV OCC+ gD。重组病毒经空斑纯化后感染Hi5细胞进行表达分析 ,细胞裂解物的SDS PAGE及Western Blot ting均显示分子量约 47kD的gD蛋白得到了特异性表达 ,其表达量占细胞总蛋白的 6 2 % ,表达的gD蛋白具有免疫原性。     

中国人红细胞生成素cDNA克隆与高效表达

以中国人正常胎肝为原料提取总RNA,逆转录合成cDNA与pCR3载体相连接,构建成pE／C表达质粒。序列鉴定结果表明,cDNA序列与国内外已报导的相比,除第2个密码子的第3个碱基系引物设计所致差异外,其余部分完全相同。利用脂质转染法将质粒转入中国白鼠卵巢细胞,获得能高效稳定表达重组人红细胞生成素的工程细胞。     

赤眼鳟Mx基因全长cDNA克隆及其经GCRV攻毒后的组织表达分析

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)的功能, 采用简并PCR和SMART RACE方法从赤眼鳟脾脏中克隆得到Mx基因全长cDNA, 并通过生物信息学方法分析其同源性, 再利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测其在脾、肝、肠、肾等9个组织中的表达, 以及感染草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of Grass carp) GCRV-104后不同时间点赤眼鳟Mx的时空表达规律。结果表明: 赤眼鳟Mx基因cDNA序列(ScMx)全长2325 bp, 包含5'-UTR 40 bp, 3'-UTR 371 bp和ORF 1884 bp, 共编码627个氨基酸, 其编码的Mx蛋白分子量约为70.9 kD, 理论等电点 pI 为 8.25, 具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征; 赤眼鳟Mx与鲫鱼Mx3同源性最高; Mx在赤眼鳟脾、肝、肠、肾等9个组织中均有表达, 其中肝脏中的相对表达量最高, 脾脏次之, 肠组织中的表达量最低; 经GCRV-104病毒感染刺激后, ScMx在肝和脾组织中的表达量显著上调, 均在48h到达峰值, 分别为对照组的10倍(肝)和5倍(脾), 且在这两个组织中的表达模式相似, 均表现为先升高后下降的波动型变化趋势。研究表明ScMx参与了赤眼鳟抗GCRV-104病毒的免疫反应。       

糖化酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pLCl为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)Sau34基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA,转化酿酒酵母BJ1991,选出具有淀粉水解酶活性的转化子,它含有编码扣囊拟内孢霉胞外糖化酶的基因片段,能发酵淀粉。琼脂糖凝胶电泳证明所插入DNA片段为5.3kb,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得糖化酶的分子量为54000。酶活最适温度为50℃,最适pH为5.5。     

细菌血红蛋白基因在产D-阿拉伯糖醇酵母菌中的克隆与表达

构建了含透明颤菌血红蛋白基因vgb和甲醛抗性基因SFA1的重组质粒pVgb EX2 ,转化到产D 阿拉伯糖醇的酵母Saccharomycessp.X 62中。转化子细胞中VHb的含量比对照菌细胞有显著提高 ,表明基因vgb在酵母细胞中得到表达。转化子发酵的D 阿拉伯糖醇产量与转化率均有提高。在重复实验中D 阿拉伯糖醇的产量最多提高了 2 7 3%。在实验条件下 ,似乎D 阿拉伯糖醇的产量与细胞VHb含量有相关性。     

COMPARATIVE EFFECTS OF TWO PHOTOSENSITIVE COMPOUNDS ON SUPEROXIDE DISMUTASE ACTIVITY IN SPODOPTERA LITURA LARVAE*

Abstract Superoxide dismutase activity was detected in the fourth instar larvae of cutworm Spodoptera litura and effects of the two photosensitive compounds, α-terthienyl and the synthesized compound 1-phenyl-4–(3, 4-methylene dioxy) phenyl-diacetylene (signified as compound No. 5), on superoxide dismutase activity, were compared under the specified condition. Results indicated that the near ultraviolet irradiation (300–400 nm) almost had no effect on superoxide dismutase activity in vivo in the control larvae but could decrease superoxide dismutase activity in vitro. After treatment with photosensitive compounds and near ultraviolet irradiation, superoxide dismutase activity in vitro could be enhanced by the two chemicals, with α-terthienyl more effective, while in vivo it was hardly affected by the latter compound but could be inhibited by α-terthienyl. This suggested that the larvae treated by a-terthienyl were more susceptible to light than that by the latter compound whenever in vivo or in vitro. The possible mechanisms of action of the two photo-activated compounds were discussed.     

杀菌通透性增加蛋白基因的克隆及在CHO细胞中的表达

从一名健康中国人外周血白细胞中克隆出杀菌 通透性增加蛋白 (BPI)基因 ,全长1 45 2bp,编码 2 7个氨基酸的信号肽和 45 6个氨基酸成熟蛋白。序列比较发现 ,此序列与国外发表的序列有 6个核苷酸的差异 ,编码蛋白有 4个氨基酸的差异。构建真核表达质粒 ,在CHO细胞中实现BPI基因的稳定表达。对重组蛋白初步纯化后进行杀菌实验 ,结果表明重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物活性。