pH对重组CHO细胞生长、单抗表达及质量的影响北大核心CSCD

在1 L反应器中探究p H对CHO细胞生长、单抗表达及质量的影响。在1 L反应器中对p H进行探究,实验研究表明当p H为7.05时最适合CHO细胞生长和抗体表达,在此条件下培养时第9天获得最高细胞密度1.54×107cells/m L,在第11天获得最高抗体浓度1 355.71 mg/L。p H对p CO2、乳酸积累、抗体的单体含量、电荷异质性和糖基化也有较大影响,当p H在6.95至7.25之间时,高p H培养能够降低乳酸积累和p CO2,但是会导致抗体的碱性峰增加。p H两项培养能够降低细胞活力,从而提高抗体表达量。     

用填充床生物反应器连续灌流培养CHO细胞生产HBsAg

为了获得重组CHO细胞持续高效表达HBsAg的最佳条件 ,应用填充床生物反应器和聚酯片 ,连续灌流培养分泌HBsAg的重组CHO细胞 ,考察灌流培养基中葡萄糖浓度对细胞代谢和HBsAg生产的影响。连续培养 60天 ,细胞密度可达 5 0× 1 0 6 ml。灌流培养液中葡萄糖浓度从5 0g L增加到 7 6g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度均随之上升。当葡萄糖浓度继续增加至9 3g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度呈下降趋势 ;当将葡萄糖浓度降回至 7 6g L后又开始回升。培养过程中最高抗原滴度达 1∶5 1 2 ,出现在以含 5 0g L葡萄糖的培养液灌流阶段的末期 ,即第 2 6天 ,维持 1 0天左右即迅速下降至 1∶1 2 8水平。共收液 335L ,纯化后获得抗原蛋白2 1 3 0 4mg ,平均产率为 635 94μg L ,较传统转瓶工艺 ( 4 1 4μg L)提高 5 3 6%。表明CHO细胞较长时间处于高乳酸水平下 ( >30mmol L)会严重影响产物的表达 ,应控制灌流培养液中的葡萄糖浓度在较低水平 ,或通过适当提高灌流速率使培养基中乳酸水平维持在较低水平 ,从而有利于HBsAg的高效稳定表达     

酵母抽提物对CHO细胞生长及抗体表达的影响

为了深入认识酵母抽提物在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长及单克隆抗体表达过程中所发挥的作用,综合考察了传代培养和批式培养过程中,不同浓度酵母抽提物条件下CHO细胞生长、抗体表达以及营养物代谢的情况。传代培养过程中,低浓度(1 g/L)的酵母抽提物能够显著促进CHO细胞的生长,高浓度(5-10 g/L)的酵母抽提物则会显著抑制CHO细胞的生长;同时,传代过程中添加酵母抽提物不会影响种子细胞在批式培养中的表现。批式培养过程中,抗体比生成速率随酵母抽提物浓度的提高而升高,浓度为10 g/L时获得最高抗体产量。通过采用细胞生长阶段低浓度、产物表达阶段高浓度的添加策略,酵母抽提物在动物细胞培养过程中可发挥巨大的应用价值。     

大型反应器内pH不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响

为了研究大型反应器中p H不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响,并将培养过程顺利地放大到生产规模,根据大型反应器的混合特性,构建了搅拌式反应器与平推流反应器串联的规模缩小装置用于模拟大型反应器中的p H不均一性。结果表明停留时间为30 s时,整个培养过程和对照相比并无显著的差异,这表明此时补碱所导致的p H不均一性并未对流加培养工艺造成影响。而随着停留时间的延长,反应器内p H不均一的程度越大,细胞生长和产物表达受到抑制越明显;与此同时,乳酸和氨的累积显著增加,而关键质量属性唾液酸和生物学活性也随之降低。     

丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响

抗p185erbB-2基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物。以稳定表达抗p185嵌合抗体的重组工程CHO细胞株为对象,分别用不同浓度丁酸钠(0~2mmol/L)和丙酸钠(0~10mmol/L)对处在对数生长期的细胞进行处理,在连续5d的培养过程中,每隔24h取样测活细胞数量,并用ELISA检测上清中抗体含量,5d后结束培养用FACS检测细胞周期。同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至90%满度的细胞,然后每隔12h取样一次检测葡萄糖和乳酸的含量。结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程CHO细胞中的表达,表达量最高时可达58.3~59.6mg/L,是对照组的1.5倍。同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在G1期,并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成。和丁酸钠相比,丙酸钠具有较小的细胞毒性,是一种有潜力的替代品。     

表达重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞灌流培养基的筛选

目的筛选重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞株培养和连续灌流表达用培养基,以提高抗体表达量。方法通过调整原有批培养用培养基中谷氨酰胺和植物水解蛋白,获得5种培养基配比。使用模拟灌注方式进行细胞培养,分析细胞密度、活细胞比率和目标蛋白表达,筛选连续灌流细胞培养和表达用培养基。最后在7 L反应器中采用灌注培养方式对筛选获得的培养基进行验证。结果使用50 mL细胞培养管进行模拟灌注培养时,活细胞比率较高,达到90%以上;CHO细胞在添加谷氨酰胺至4.0 mmol/L和植物水解蛋白至5.0 g/L的批培养用培养基中生长速度最快;在基础培养基中抗体表达量比优化前高15%。20 d培养周期内,优化的培养基在7 L反应器中可以维持CHO细胞密度在(2 727±253)万个/mL,活细胞比率在95%以上。结论通过模拟灌注培养,筛选获得了一种在7 L反应器灌流培养中适宜于重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞表达的培养基。     

氨浓度升高对CHO细胞维持期抗体融合蛋白的表达及N-糖基化的影响

为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系。结果显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响。但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化。当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低。因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降。     

机械搅拌式动物细胞反应器不同桨型组合的CFD数值模拟与优化

生物反应器已成为哺乳动物细胞生产治疗性抗体药物和疫苗的核心。文中采用CFD数值模拟方法对目前常用的机械搅拌式生物反应器在不同的搅拌形式下的流场进行了分析,获得了5种搅拌桨型组合条件下的速率矢量、持气率、含气率和剪切力分布的特征。通过构建的重组CHO细胞在不同搅拌形式条件下的流加分批培养发现,细胞密度和抗体表达水平与反应器内的最大剪切率直接相关,在FBMI3搅拌形式下细胞密度和抗体表达水平均最高。结果表明该CHO细胞在悬浮培养时对剪切环境比较敏感,且最大剪切力是工业规模放大的关键因素。     

基于DOE设计和氨基酸补加策略提高CHO细胞表达抗CD20单克隆抗体*

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)流加培养生产单克隆抗体是目前主流培养方式,其中环境参数(pH和温度)和营养成分均影响细胞生长、碳氮源代谢和外源蛋白表达,是培养过程中关键的控制参数。采用实验设计(design of experiment,DOE)方法研究培养参数(温度、pH)对CHO细胞生长和抗CD20抗体表达的影响,建立营养限制型氨基酸流加策略,实现抗CD20抗体的高表达。结果表明,温度是影响蛋白质表达的显著因素,35℃有助于提高细胞密度和目标抗CD20抗体表达,而pH对抗CD20表达影响不显著,且温度和pH无交互作用,经DOE预测分析最佳培养条件是温度35℃和pH7.0。在该最佳培养条件下,在培养后期酪氨酸和半胱氨酸的浓度都低于0.1mmol/L。在培养的第2天通过补加1.5mmol/L酪氨酸和1mmol/L半胱氨酸避免营养限制,抗CD20抗体表达水平提高了24.1%,且对蛋白糖型无影响。     

基于DOE设计和氨基酸补加策略提高CHO细胞表达抗CD20单克隆抗体*

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)流加培养生产单克隆抗体是目前主流培养方式,其中环境参数(pH和温度)和营养成分均影响细胞生长、碳氮源代谢和外源蛋白表达,是培养过程中关键的控制参数。采用实验设计(design of experiment,DOE)方法研究培养参数(温度、pH)对CHO细胞生长和抗CD20抗体表达的影响,建立营养限制型氨基酸流加策略,实现抗CD20抗体的高表达。结果表明,温度是影响蛋白质表达的显著因素,35℃有助于提高细胞密度和目标抗CD20抗体表达,而pH对抗CD20表达影响不显著,且温度和pH无交互作用,经DOE预测分析最佳培养条件是温度35℃和pH7.0。在该最佳培养条件下,在培养后期酪氨酸和半胱氨酸的浓度都低于0.1mmol/L。在培养的第2天通过补加1.5mmol/L酪氨酸和1mmol/L半胱氨酸避免营养限制,抗CD20抗体表达水平提高了24.1%,且对蛋白糖型无影响。     

金属离子对CHO细胞抗体表达及抗体电荷分布的影响

旨在深入认识金属离子在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养生产单克隆抗体过程中所发挥的作用。综合考察了不同铜离子和锌离子浓度下CHO细胞的生长、抗体的表达以及抗体的电荷分布情况。结果显示,一方面,当培养基中铜离子浓度为120 nmol/L、锌离子浓度为50μmol/L时,最有利于CHO细胞的生长和抗体的表达。过高或过低的铜离子和锌离子均对细胞的生长和活性的维持产生了不利影响。另一方面,作为碱性羧肽酶抑制剂和辅因子的铜离子和锌离子对抗体的电荷分布有着重要的影响。当培养基中铜离子浓度为50 nmol/L、锌离子浓度为50μmol/L时,最有利于减少抗体的电荷变体,提高主峰含量。过高或过低的铜离子和锌离子均导致了电荷变体的增加,主峰含量的降低。且两者的浓度和比例影响了抗体C末端赖氨酸的酶切过程,进而影响了碱性变体的含量。此外,对铜、锌离子的操作空间进行了初步的研究。金属离子在CHO细胞培养过程中对细胞的生长、抗体的表达以及抗体的电荷分布等方面都发挥着重要的作用。     

不同降温温度对抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长及蛋白表达的影响

目的 摸索适合抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长和抗体蛋白表达的降温温度,为细胞培养工艺的建立提供参考。方法 在体积为125 mL的培养瓶中,按50万个/mL的初始密度接种CHO工程细胞种子,采用补料分批培养模式,在转速125 r/min, CO₂浓度5.0%,湿度80%的温控培养摇床中进行细胞培养。对照组培养温度设定为37℃恒温;试验组初始培养温度设定为37℃,待培养瓶中的细胞密度达到1 000万个/mL时,将培养瓶分别转到35℃、34℃和33℃的摇床继续培养。每日取样,分别检测培养液的活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸、NH⁺₄、渗透压和抗体蛋白滴度。当细胞活率<80%时,停止培养。与对照组比较,选择细胞生长较好,代谢副产物浓度较低且抗体蛋白滴度最高的温度为最终降温温度。结果 对照组的最高活细胞密度为2 000万个/mL,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃培养条件下的最高活细胞密度分别为2 210万、1 940万和1 890万个/mL;与对照组相比,试验组培养后期的细胞活率维持较高...     

运用氨基酸分析法和DOE法优化抗PD-1单克隆抗体生产用培养基

本研究采用氨基酸分析法结合DOE设计法优化并获得高表达抗PD-1单克隆抗体生产用基础和补料培养基。通过对市售多种基础和补料培养基进行筛选,获得细胞生长状况较优的基础培养基和抗体表达较高的补料培养基,利用氨基酸分析法检测较优基础培养基和补料培养基中氨基酸消耗情况,确定影响细胞生长和抗体表达的关键氨基酸种类,利用DOE分析软件设计分别在较优基础和补料培养基中添加不同浓度的氨基酸种类及浓度,根据细胞生长及抗体表达,优化得到抗PD-1单克隆抗体的基础和补料培养基组合。最终优化后基础培养基配方为:Hycell CHO培养基中添加1.04 mmol/L L-天冬酰胺和0.76 mmol/L L-谷氨酰胺。最终优化后补料培养基配方为:OPM CHOCD Feed1补料培养基中添加38.7 mmol/L L-组氨酸,75.0 mmol/L L-酪氨酸,64.0 mmol/L L-丝氨酸,49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸。经过3 L反应器培养验证,优化后的培养基比未优化时,最大活细胞密度(PVCD)提高了62.7%,抗PD-1单克隆抗体表达量提高了71.5%,且活性无明显差异。     

表达内皮抑素的rCHO细胞的微囊化培养

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,如果将此技术应用到临床研究,就需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊。种子细胞是生物微胶囊治疗作用的执行者, 是构建微囊微反应器的基本元素。如何获得大量高活性的种子细胞已经成为规模化制备生物微胶囊所面临的最关键的限制因素。本实验考察了搅拌式生物反应器内扩增的重组CHO细胞进行包囊及微囊化细胞在生物反应器内规模化培养的可行性。实验结果显示:重组CHO细胞在生物反应器内可以快速生长,并且对数期细胞包囊,微囊化细胞活性良好。制备的微囊化细胞可以在生物反应器内培养,与培养板培养比较细胞生长较快、内皮抑素表达量较高。应用生物反应器培养技术能够在体外快速、大量扩增重组CHO细胞,满足微囊化细胞制备对种子细胞量与质的要求,微囊化细胞可以在生物反应器内培养。     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107／mL,活细胞比率维持在90％以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×107／mL,活细胞比率维持在95％以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10％～20％,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100L上清中获得约80gu-PA(单链比例约为90％)。     

分泌重组抗体的CHO细胞体外培养条件的优化

目的：对生物反应器细胞培养时培养时培养基组成进行优化。方法：以稳定转染了抗CD3人源化抗体的CHO细胞为模型,以无血清培养基经生物反应器高密度细胞培养后分子量小于50kDR的超滤液为基础培养基,在细胞培养板中考察添加氨基酸、丁酸钠、柠檬酸铁等多种成分对细胞生长状态和蛋白表达量的影响、结果：2mmol/L丁酸钠可以有效地诱导蛋白的表达,丁酸钠和柠檬酸铁对于促蛋白表达有协同作用,适量添加培养过程中消耗较快的氨基酸可提高细胞数和蛋白的表达量。结论：利用所述方法可快速优化培养基成分,显著提高生物反应器中细胞的蛋白表达量。     

甘草细胞在搅拌式生物反应器中的放大培养

在建立了稳定的甘草细胞搅拌式生物反应器放大培养体系的基础上,本文研究了甘草细胞在搅拌式反应器中悬浮培养的生长特性,包括细胞生长、细胞膜的透性、培养体系的p H变化及甘草黄酮合成情况等,并与摇瓶培养作比较。结果发现,同等条件下,反应器中培养细胞生物量的积累低于摇瓶培养,整个培养周期较摇瓶培养缩短。培养过程中同一时间段反应器中的p H值略低于摇瓶中的p H,细胞中H2O2的浓度是摇瓶中的1.8倍,甘草黄酮的产量是摇瓶培养的1.5倍,表明反应器中机械搅拌与流体剪切的培养环境对细胞生长起到一定程度的抑制作用,但刺激了细胞次生代谢产物甘草黄酮较高水平的合成。     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107/mL,活细胞比率维持在90%以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×10⁷/mL,活细胞比率维持在95%以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10%～20%,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100 L上清中获得约80guPA(单链比例约为90%)。     

用填充床生物反应器大规模培养表达重组人红细胞生成素的细胞株

目的：用填充床生物反应器培养表达重组人红细胞生成素的工程细胞株C2W,使其达到高密度高表达。方法：将工程细胞株用含5％小牛血清的DF培养基复苏放大培养,当细胞达到10^9时,接种到5L生物反应器中,先用含血清培养基生长培养,再换为无血清培养基表达培养;在整个培养过程中,采用流加方式连续培养,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定细胞的表达水平。结果：接种量约为10^9细胞;细胞罐培养57d,包括含血清生长培养6d,无血清表达培养51d：重组人红细胞生成素平均表达水平为5636U／mL,最高时达7880U／mL;收集无血清培养上清476L,平均每日灌流量8.3L,最高时达12L／日。结论：在适当的条件下,利用填充床生物反应器可使工程细胞株的培养达到长时间、高表达。     

CHO工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型

以悬浮适应的表达尿激酶原CHO工程细胞为研究对象,在100mL的摇瓶中进行无血清悬浮培养,以细胞密度、细胞活力、Pro-UK活性、葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生产速率(qlac)、乳酸对葡萄糖的得率系数(Ylac/glc)为观察指标,同时以细胞有血清悬浮培养作为参照,考察CHO工程细胞无血清悬浮培养生长和代谢特征。观察结果表明,CHO工程细胞在无血清及有血清悬浮培养条件下表现为大致相似的细胞生长和代谢特征。在此基础上,依据实际检测的数据,应用MATLAB软件对细胞对数生长期的细胞生长、乳酸生成及葡萄糖消耗的模型参数进行非线性规划,获得全局性收敛的最优参数估计值,建立了细胞在无血清培养条件下的生长及代谢动力学模型。