间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了针对纯化中国仓鼠卵巢细胞表达乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的不同间臂(3C、8C和10C)和不同配基密度的丁基疏水介质。配基密度的增加和间臂C链的延长都会增加介质的疏水性,从而影响其对CHO-HBsAg的分离效果。采用正交实验考察了配基密度、盐浓度、pH值三个影响因素对不同间臂疏水介质性能的影响。以分离CHO表达的乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的收率和纯化倍数为主要指标。根据正交试验结果,分离效果最佳的介质间臂为8C、配基密度为22μmol/mL。该介质在硫酸铵浓度9%、pH7.0条件下,CHO-HBsAg的收率可以接近100%,纯化倍数达到60。     

乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的分离纯化及生物活性鉴定

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了不同配基密度的SP(Sulfopropyl,磺酸基)离子交换介质,建立了乳腺生物反应器表达重组人乳铁蛋白(Recombinant Human Lactoferrin,rHLF)的纯化方法。以溶菌酶为模型蛋白考察了不同配基密度离子交换介质的静态和动态吸附行为,结果表明介质具有良好的吸附性能。不同配基密度离子交换介质均可纯化得到rHLF,其中,高配基密度(0.24mol/L)的离子交换介质每毫升可以处理50mL rHLF牛乳,rHLF收率为86.5%,纯度为98.5%。圆二色谱的测定结果表明纯化的rHLF二级结构与天然人乳铁蛋白一致。生物学功能实验结果表明,rHLF的铁结合与释放活性与天然人乳铁蛋白相似,浓度为5g/L的rHLF对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用。     

界面上配基种类对BSA吸附行为的影响

利用双偏振极化干涉测量仪(DPI)研究了界面上配基种类对BSA吸附行为的影响。采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(甲氨基)丙基三甲氧基硅烷(MAPTMS)和N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(DAPTMS)对DPI芯片进行了修饰,利用X射线光电子能谱比较了芯片上不同配基的密度,采用原子力显微镜(AFM)和DPI对界面上BSA吸附行为进行了研究。结果表明APTES修饰界面上BSA呈饼状,高配基密度易导致BSA多位点吸附。相同偶联密度条件下BSA在DAPTMS修饰芯片的吸附量高于MAPTMS修饰芯片,但吸附层厚度一致,表明DAPTMS表面上BSA存在聚集现象;AFM扫描结果与DPI分析结果一致,证明了配基密度和种类不仅影响界面上蛋白质吸附量,而且影响蛋白质吸附密度和表面聚集行为。     

基于分子模拟的离子交换层析中静电相互作用研究

将分子模拟方法引入到蛋白质离子交换层析中的静电相互作用研究。选用蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶为模型蛋白质,阳离子交换吸附剂SP Sepharose FF等为模型层析介质。从蛋白质数据库(PDB)中获得蛋白质三维结构数据,分析了介质孔径和配基分布,以点电荷模拟离子交换层析介质的功能配基,构筑了蛋白质-介质配基模拟表面体系。采用MCCE、Delphi和GRASP等程序包进行了分子模拟计算,考察了作用方向、作用距离、盐浓度、pH等对蛋白质和模拟配基平面间静电相互作用的影响。结果表明,宏观的层析平衡常数与微观分子模拟计算的相互作用能量参数间存在良好的线性关系。     

亲和介质及溶液条件对蛋白质溶液中内毒素去除的影响

生物制品中内毒素的去除是一项十分重要的工作。为了更好地去除各种生物制品中的内毒素,采用合成的多粘菌素B琼脂糖亲和介质,通过静态吸附的方法去除蛋白质溶液中的内毒素。重点考察了介质的间臂长度、配基密度以及各种溶液条件(pH值、盐种类和浓度、蛋白质种类和浓度、内毒素浓度、添加剂等)对内毒素去除率及蛋白质回收率的影响。分别采用动态浊度法和Lowry法检测内毒素含量和蛋白质浓度。结果表明该介质具有载量高、去除速度快、去除率高、可重复使用的特点。此外,配基密度、pH值、盐浓度和蛋白质特性(等电点和疏水性)对内毒素去除效果均有重要影响。在优化的条件下,血红蛋白、人血清白蛋白和溶菌酶的回收率分别达到87.2%、73.4%和97.3%,相应的内毒素去除率分别达到99.8%、97.9%和99.7%。阐明了各种因素对内毒素去除率和蛋白质回收率的影响规律,为生物制品中内毒素的高效去除提供了参考。     

上皮生长因子受体和癌胚抗原分子内血型Y配基表达的免疫生化分析

以抗CEA、EGF-γ和血型前体Y配基抗原的单抗进行分析,结果表明:结肠癌组织中表达CEA和血型前体Y配基较强,而EGF-γ表达水平极低;进一步鉴定分析,识别血型前体Y配基抗原决定簇的单抗C_(14)与肿瘤具有较好的反应性。并发现这种决定簇存在于各种生物大分子中,包括以糖蛋白和糖脂形式存在,并表达于EGF-γ与CEA分子中。这一结果提示血型前体抗原过量表达于肿瘤细胞中,不但是血型组织相容抗原,可能也参与到一些特殊生物分子中,应深入研究和鉴定其功能。     

氨基酸肽和蛋白质的色谱分析及色谱法制备

<正> CA 97(15)122707j J低渗洗脱—一种新的免疫吸附色谱解吸原理。Danielsen,E.Michael et al.,J.Immunol.Methods,1982,52(2), 223-32(英文)CA 97(15)123222j J 合成化学配基在蛋白质亲和色谱中的应用。     

兔子子宫内膜雌激素受体的超离心分析

用蔗糖密度梯度超离心技术分析了兔子子宫内膜胞质液无配基ER和激素受体复合物。在低离子强度和高盐浓度条件下ER的沉降行为主要表现为8S和4S的分子。对不同实验条件下受体的稳定性进行了比较,无配基ER在低离子强度介质中易聚合成比8S更大的分子。胞质液中E_2的存在有利于受体稳定,超离心后可用[~3H]E_2交换,DCC法测定,结果与传统的超离心法一致。     

兔子子宫内膜雌激素受体的超离心分析

用蔗糖密度梯度超离心技术分析了兔子子官内膜胞质液无配基ER和激素受体复合物。在低离子强度和高盐浓度条件下ER的沉降行为主要表现为8S和4S的分子。对不同实验条件下受体的稳定性进行了比较,无配基ER在低离子强度介质中易聚合成比8S更大的分子。胞质液中E_2的存在有利于受体稳定,超离心后可用[~3H]E_2交换,DCC法测定,结果与传统的超离心法一致。     

乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒表面抗原密度对抗体应答水平的影响

【目的】为了探究乙肝病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein,HBc)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)表面抗原密度对免疫后抗体应答水平的影响,制备了不同抗原密度的HBc VLPs疫苗,并检测了其在小鼠体内的抗体应答水平。【方法】首先制备了N端带有3个甘氨酸的人巨细胞病毒重组抗原域AD-4作为模式抗原,接着通过Sortase A的介导将AD-4连接到HBc VLPs表面上。将系列浓度梯度AD-4抗原在SortaseA介导下分别与相同浓度的HBcVLPs发生反应,制备不同抗原密度的HBc-AD-4 VLPs。将其分别免疫6–8周龄BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔2 w,间接ELISA法检测被免疫小鼠血清的抗体应答水平。【结果】结果表明,当HBc VLPs表面抗原密度为44.4%时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1:0.5时,不足以引起高滴度的抗体产生;当HBc VLPs表面抗原密度为64.2%时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1:1时,HBc-AD-4 VLPs诱导的AD-4特异性抗体滴度与100%抗原密度的HBc-AD-4VLPs所引起的抗体滴度相当;当HBcVLPs表面抗原密度大于64.2%时,引起的抗体应答水平不因抗原密度增加而进一步增强。【结论】发现了HBcVLPs表面抗原密度与免疫后抗体滴度呈正相关,然而免疫64.2%抗原密度的HBc VLPs所产生的抗体滴度可达峰值,抗原密度进一步增加,抗体应答水平不会进一步加强。     

HFRS疫苗佐剂吸附前后加入保护剂对其免疫原性的影响

为提高肾综合征出血热(HFRS)双价纯化疫苗抗原的有效利用率,在保证疫苗免疫效果的前提下,合理地降低疫苗的成本,确定最佳疫苗配制方法和最合适的疫苗浓缩倍数。将抗原含量不同的出血热纯化疫苗原液及疫苗配制的两种主要成分———人血白蛋白和A l(OH)3佐剂按不同的配制顺序配制成4批纯化疫苗,分别抽样,测其上清液中抗原量并做效力试验。结果表明人血白蛋白和A l(OH)3佐剂加入的顺序不同,配制的4批纯化疫苗上清液抗原量也不同,效力试验结果显示其中和抗体阳转率(PRNT)也有很大差别。因此在纯化疫苗的配制过程中,人血白蛋白和A l(OH)3的加入顺序影响到佐剂A l(OH)3对疫苗抗原的吸附,也影响到疫苗的免疫效果;先加A l(OH)3再加人血白蛋白的疫苗免疫效果要好于先加人血白蛋白再加A l(OH)3的疫苗。     

头孢唑啉为配基亲和层析纯化尿激酶

利用头孢类抗生素头孢唑啉为配基,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ为载体,用环氧氯丙烷活化法制得头孢唑啉－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和载体,配基密度为４３μｍｏｌ／ｇ湿胶。吸附尿激酶的最佳条件为ｐＨ６．０和１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ;最大吸附量为１１００００ｕ／ｇ湿胶,洗脱条件为含０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ,ｐＨ９．０,０．１ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸缓冲液。将比活为５００ｕ／ｍｇ的尿激酶粗品进行层析,得到比活为４９     

亲硫吸附层析法分离血清蛋白

人血清蛋白是用二乙烯砜( divinyl sulfone)活化的琼脂糖和β-疏基乙醇反应得到的基质(所谓T-凝胶)进行分离的。在高硫酸铵浓度下,几乎束缚所有的血清蛋白。其洗脱过程是采用逐步降低洗脱缓冲液的盐浓度完成的,洗脱收集的各级分是用熔合火箭免疫电泳法分析的。这种亲硫吸附层析一步法具有分辨力强和蛋白质回收率高的优点。用T-凝胶可快速、简便地从粗兔血清分离出基本纯的免疫球蛋白,其得率至少80％。     

幽门螺杆菌尿素酶抗原的分离及纯化

本实验采用新型离了交换剂Ｓｏｕｒｅｃｅ Ｑ１５为分离介质,用氯化钠盐浓度梯度洗脱法,从幽门螺杆菌超声处理上清液中纯化了幽累相菌尿毒酶抗原,所得纯化物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析证明具有良好的纯度,只含有分子量为６６０００及２９５００两种蛋白成分,与幽门螺杆菌两种亚基的大小安全相同。以此纯化尿素酶为抗原用于ＥＬＩＳＡ检测临床确诊的幽门螺杆菌感染者血清１２全水感染幽门螺杆者血清１８例,其ＥＬＩＳＡ阳性及     

小鼠肠道菌群HPLC分析中色谱分离条件的优化

研究了在小鼠肠道菌群的高效离子交换色谱（HPLC）分析中,不同色谱分离条件对分离效果的影响,确立了最佳色谱条件：样品上样于Toyopearl TSKgel SuperQ-650c强阴离子交换树脂柱,以0.02mol/L哌嗪-HCl缓冲液（pH8.0）平衡,洗脱盐浓度为1.0mol/L NaCl,洗脱梯度为0.1-0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱80min,再经0.5-0.75mol/L NaCl线性梯度洗脱25min,流速1mL/min,进样量为1mL。小鼠肠道菌群HPLC分析方法的建立,为深入研究小鼠肠道菌群的组成和动态变化奠定了基础。     

金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究

金属螯合亲和层析是近20年发展起来的一项新型分离技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文从单组分蛋白质入手,考查了pH值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响,并进行了分析。还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究,比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别,为实际体系的分离研究打下了基础。     

酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒的纯化和鉴定及其透射电镜观察

乙肝核心抗原(HBcAg)蛋白基因(C基因)在酿酒酵母中表达,表达产物经过分离和Sepharose CL-4B柱子的初步纯化。产物经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为一分子量约21.5kDa的多肽。再经蔗糖密度梯度超离心和CsCl等密度梯度超离心等过程而被纯化。分管收集的超离心纯化产物经ELISA抗原活性检测和密度分析,可知ELISA反应强度较高的收集管中的颗粒密度主要分布在1.27g/mL和1.40 g/mL两个峰值处。将rHBcAg抗原活性最高的收集管合并,再经TEM观察,发现酵母表达的rHBcAg蛋白(核心蛋白)能自主装配成大小不同的两种核心颗粒,大颗粒直径约为30.1±2.4 nm,小颗粒直径约为21.5±3.3 nm。这表明,酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒具有大小不同的二态性,其生物学意义还未明了,需进一步研究和探讨。     

AM真菌对留兰香和常夏石竹耐盐性的影响

为探究接种丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌对不同盐胁迫水平下留兰香和常夏石竹侵染特性与生理指标的影响,该研究采用盆栽试验的方法,将留兰香和常夏石竹分为接种处理与对照处理,并施加不同浓度(0、50、100、150、200 mmol/L)的NaCl胁迫,胁迫结束后测定两种植物的侵染特性与生理指标。结果表明：(1)随着盐浓度的升高,留兰香和常夏石竹的侵染率、侵染强度、丛枝丰度和泡囊丰度均不断下降,且常夏石竹的各项侵染指标总体上均高于留兰香。(2)接种AM真菌提高了各盐浓度下留兰香和常夏石竹的总叶绿素含量以及可溶性糖与可溶性蛋白含量,同时显著降低了二者在不同盐浓度条件下的脯氨酸含量。(3)接种AM真菌在不同程度上提高了留兰香和常夏石竹体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性;并降低了在不同盐浓度条件下留兰香和常夏石竹的丙二醛含量。研究发现,接种AM真菌可以在不同程度上提高盐胁迫下留兰香和常夏石竹渗透调节能力和抗氧化酶系统活性,增强了植物的耐盐能力,从而使植物在盐胁迫条件下更好地生长。     

噬菌体抗体库技术制备高亲和力人抗体

噬菌体抗体库技术的基本原理是将全套抗体可变区基因组装到丝状噬菌体表达载体内 ,与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因融合并表达到噬菌体表面 ,以固相化的抗原作配基 ,通过吸附 洗脱 扩增的富集过程 ,筛选到与抗原特异结合的抗体克隆 ,并得到相应的抗体可变区基因。因此噬菌体抗体库技术可以被认为是体内抗体生成过程的模拟 ,首先建立足够多样性的抗体库 ,然后通过免疫亲和筛选即可能得到针对任何抗原的人抗体。该技术省时省力 ,无...     

壳聚糖-Zn(Ⅱ)亲和层析介质的制备及表征

以自制的壳聚糖微球为载体,环氧氯丙烷(ECH)为活化剂,亚氨基二乙酸(IDA)为螯合配基,Zn2+为螯合金属离子制备壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质。最佳活化工艺:M壳聚糖(g)∶VECH(m L)为1∶4、Na OH浓度为1.2 mol/L、活化温度为50℃,活化时间为4 h,测得环氧基修饰密度达0.2472 mmol/g;最佳螯合工艺:IDA作为配基、浓度为0.6 mol/L、反应温度为70℃、反应时间为6 h,Zn Cl2作为螯合金属盐、浓度为0.1 mol/L、反应时间为3 h,Zn2+螯合量达到最大值。通过红外光谱表征,证明壳聚糖与Zn(II)发生了螯合配位反应,生成了壳聚糖-Zn(II)配合物。