FLAG融合短肽在重组蛋白质纯化中的应用

FLAG融合标签由八个氨基酸组成(AspTyrLysAspAspAspAspLys),专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。现已发展出了多个针对该短肽的抗体,包括M1、M2和M5单克隆抗体。FLAG标签与融合的重组蛋白质之间一般含有一个肠激酶切割位点,可以用肠激酶切割除去。FLAG融合标签技术具有简单、快速进行定量检测的优点,在重组蛋白质的分离纯化中应用广泛。     

蛋白质纯化技术研究进展

蛋白质组学研究的基础就是蛋白质的分离。对于天然蛋白来说,可能需要一系列的纯化步骤才能获得纯度满足研究要求的蛋白质,但是蛋白质在分离过程中常常由于溶液环境变化或外力作用造成构象变化而引起失活。本文首先介绍了常用的蛋白质分离纯化技术及其研究进展,包括膜分离技术、沉淀分离技术、电泳分离技术以及层析分离技术等常用的蛋白质纯化技术,总结了现有技术存在的问题,并对近年来发展的新型蛋白质分离技术--非对称流场流分离技术进行了介绍和展望。     

融合标签技术及其应用

融合标签最初是作为一种有效的工具用于纯化重组蛋白质,近几年的研究表明,融合标签的作用并不局限于此。本文综述了融合标签技术的发展及在生命科学研究中的各种应用,包括重组蛋白质的纯化;目的蛋白质的检测、定向固定;体内生物事件的可视化;提高重组蛋白质的产量;增强重组蛋白质的可溶性及稳定性。     

胞内蛋白的选择性提取

生物技术如ＤＮＡ重组、细胞融合技术,已使应用微生物廉价地大规模生产有价值的生物产品如：胰岛素、葡萄糖苷酶等成为可能。但很多基因重组蛋白是以胞内包涵体形式存在的,这些胞内蛋白制品在纯化过程中,由于步骤多、最终收率低,极大提高了生产成本。据统计,在蛋白制品生产中,分离和纯化费用占总生产费用的８０％以上［１］。因而开发新型生化分离技术,生产胞内蛋白质已成为工业生产的核心问题。 减轻蛋白质后处理工艺的负荷最根本的方法是尽量减少目标蛋白提取时非目标杂质的混入。传统胞内产物分离纯化的第一步是细胞破碎,破碎方…     

毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

随着基因重组技术的快速发展,基因工程产品的利用越来越广泛,但其分离纯化的成本约占总成本的60%～70%.因此,探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要.简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系,着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况.     

类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用

类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签.这种人工合成的蛋白质多肽是由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成,具有温度诱导的可逆相变特性.ELP与目的蛋白融合后,赋予重组蛋白相类似的可逆相变性质.多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)之后,就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白,再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除ELP标签,从而得到单一的目的蛋白,实现简单快速分离纯化重组蛋白.目前,该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中.大肠杆菌表达ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可达1.6 g/L.这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点.重点从该技术的原理、技术路线以及发展方向进行综述.     

重组蛋白下游连续纯化技术的研究进展

重组蛋白质的纯化一直是限制其生产的瓶颈环节,传统纯化工艺以批次模式为主,普遍存在成本高,处理效率及回收率低等问题。近年来,随着连续离心,过滤,层析技术的开发和应用,传统工艺的缺陷得到有效的克服。主要以下游纯化工艺为主线,对工业大规模纯化过程中所涉及的连续技术的特点及应用进行了归纳分析。对纯化工艺中的核心技术-层析,以及未来重组蛋白质的纯化技术进行了展望,旨在为重组蛋白质生产工艺的优化提供新的理论依据和指导思想。     

固定化金属螯合亲和膜纯化重组抗菌肽研究

用自行制备的固定化金属螯合亲和膜对N端含六个组氨酸标记的重组抗菌肽进行了分离纯化,并较好地解决了金属离子泄露问题.实验表明,固定化金属螯合亲和膜性能优于传统琼脂糖凝胶介质,完全适用于分离纯化含有多组氨酸标记的重组蛋白质.     

高效毛细管电泳

在过去十年里,应用重组DNA方法生产药用治疗蛋白推动了分析和鉴定生物分子新技术的发展。高效毛细管电泳(HPCE)使生物化学家、分析化学家以及层析工作者产生了极大的兴趣,现已成为一个分辨率极高的分离技术,其分离效率和应用广度胜于高效液相色谱法(HPLC)。人们预计,HPCE将成为生物技术产业,尤其是高度精确地鉴定重组DNA产物的一个重要工具。迄今为止,在此领域里应用最多的仍然是HPLC(蛋白质分析和纯化)和凝胶电泳(蛋白质及核酸分析)。     

外源基因在大肠杆菌中表达研究进展

近年来,基因工程技术的迅速发展,大量有价值的蛋白质大肠杆菌中获得了高表达。多种表达系统的完善与发展,及蛋白质分离纯化技术的提高,异源蛋白的产量与纯度已不再是困扰人们的主要问题,人们开始更多地关注异源蛋白的活性,比活性及异源蛋白的正确性,完整性。随着这些问题的解决,重组蛋白的应用才能真正走向成熟。     

Thermal Shift Assays在重组森林脑炎病毒丝氨酸蛋白酶纯化中的应用

应用Thermal Shift Assays技术,高通量优化了重组森林脑炎病毒丝氨酸蛋白酶纯化过程中所使用的缓冲液中盐的种类和pH,显著改善了该重组蛋白在纯化过程中出现可溶性聚集体的现象。最终获得的重组蛋白质单体量由原先的75%提高到99%以上,极大提高了该纯化蛋白质的均一性和质量,为后续的蛋白质结晶研究奠定了基础。     

重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展

重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.     

蛋白质分离纯化方法的研究进展

蛋白质作为生命物质基础之一,存在于自然界中复杂的混合体系中。蛋白质在细胞中的含量极低,将其从复杂体系中分离出来并保持其活性,难度较大,因此分离纯化蛋白质的方法受到生命科学领域广泛关注。本文首先阐述了蛋白质的预处理,其次阐述了蛋白质分离纯化的各种方法如沉淀、层析、离心等,重点阐述了蛋白质新纯化的各种原理,以及每种方法的适用范围。有助大家更全面、更彻底的了解蛋白纯化技术的发展,以期为今后开展蛋白质的制备及应用提供一定理论依据和实验指导。     

重组蛋白质纯化技术

90年代以来 ,基因重组技术得到很大的发展 ,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的 6 0 %～ 80 %,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。着重介绍了扩张柱床吸附层析技术 ,径向膜层析技术 ,灌注层析技术 ,液液萃取技术 ,置换层析技术和金属螯合亲和层析技术近年来进展情况以及它们的优缺点和应用范围。     

血浆蛋白分离纯化的进展——亲和技术的重要作用

从血浆中分离纯化各种药用蛋白质仍然是生物技术的重要产业。分离纯化技术的进展使得一血多用成为可能 ,大大降低了产品成本。其中 ,亲和技术扮演了重要的角色。经过 2 0多年的进展 ,亲和层析已经从实验室走进产业化 ,以其高选择性、高活性回收率和高纯度等特点 ,成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一。在血浆分离中 ,以乙醇沉淀或离子交换层析预处理后血浆组分为原料 ,用亲和层析可高效地获得目标血浆蛋白。综述了近年来各种亲和层析在血浆蛋白分离制备中的应用 ,并展望了血浆蛋白分离纯化发展的趋势。     

重组保幼激素酯酶的纯化和生物学效应

培养昆虫细胞生产重组昆虫保幼激素酯酶时细胞培养液的蛋白质浓度为153.2～188.0 μg/mL。批量处理纯化重组保幼激素酯酶时酶蛋白活力回收率33%,效果与梯度分离方法相当,但简便快速,可作为大量分离纯化的第一步。重组保幼激素酯酶对烟草天蛾Manduca sexta幼虫的生物学活性测定结果验证了重组保幼激素酯酶对烟草天蛾幼虫和自身天然酶有相似的生物学活性。     

重组蛋白质纯化中切割蛋白酶的选择与应用进展

现代生物医药的发展越来越依赖大分子药物的开发与应用,其中蛋白质药物所占的比重越来越高,生产需求进一步加大.重组蛋白质技术作为一种方便的蛋白质生产来源,日益得到广泛运用.重组蛋白质纯化过程中往往使用到融合亲和纯化标签,然而这些冗余的标签在蛋白质精细化生产中,尤其是作为蛋白质医药存在时,是必须被予以去除的.切割蛋白酶发挥着不可替代的作用.本文就现有的各种常用切割蛋白酶进行比较和总结,为重组蛋白质生产与科研者提供参考.     

蛋白质复性技术

重组蛋白质的过表达常导致其在胞内发生错误折叠和聚集,形成被称为包含体的聚集体。因此,蛋白质复性是许多基因重组蛋白质药物生产过程的重要步骤。本文简要介绍包含体提取、纯化和溶解工艺,重点阐述蛋白质复性技术,包括稀释复性、稀释添加剂、人工分子伴侣、柱色谱复性和反胶团溶解复性等。最后展望蛋白质复性技术的发展和应用,特别是荷电介质对同电荷蛋白质复性的促进作用。     

肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建

目的:平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chainkinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,本实验利用分子生物学技术构建了肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体,并纯化出重组的MLCK表达的蛋白质,为深入研究MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制提供了实验基础.方法:利用野生型MLCK全长的cDNA序列设计CaM结合位点的突变引物,利用PCR技术进行定点突变,获得CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK).在大肠杆茵中表达重组CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK),通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白.结果:构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK),△CaM/MLCK在大肠杆菌中以可溶形式大量表达并得到纯化.结论:成功构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)并获得纯化的表达蛋白质.     

金属螯合亲和层析的应用研究进展

金属螯合亲和层析是近30年来出现的一种新型的分离纯化技术,它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一.其在蛋白质、酶和核苷酸纯化以及蛋白质分析等方面具有广泛的应用.而随着研究的进一步深入,其新应用也越来越广泛的被发现.