PHB/PLLA组织工程前交叉韧带支架材料改性的实验研究

目的:探索体外构建组织工程前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)的三维支架材料。方法:以聚羟基丁酸已酯/聚左旋乳酸(PHB/PLLA1:1)制备"三明治"样结构共聚物并测量其孔隙率等指标。以I型胶原对制备的PHB/PLLA支架进行杂化,获得PHB/PLLA胶原杂化支架。扫描电镜观察其表面结构。将兔皮肤成纤维细胞(SF)接种于PHB/PLLA支架与PHB/PLLA胶原杂化支架,观察其在材料上生长情况。结果:PHB/PLLA支架杂化后胶原填充于纤维空隙,分布比较均匀。体外培养的胶原杂化支架材料上要比PHB/PLLA支架有更多的皮肤成纤维细胞生长。结论:胶原杂化有利于细胞种植和生长,PHB/PLLA胶原杂化支架具有良好的三维构型和生物相容性,有望为前交叉韧带损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

自组装IKVAV多肽纳米纤维支架凝胶及其对嗅鞘细胞的作用

旨在观察自组装IKVAV多肽纳米纤维支架凝胶对鼠嗅鞘细胞(OECs)的作用。通过调整IKVAV溶液pH值并加入培养液触发多肽自组装为支架凝胶, 用原子力显微镜检测IKVAV分子可以自组装成编织状纳米纤维(直径为3~5 nm)。采用原代分离培养方法获得OECs单细胞悬液后, 使用差速贴壁法两次纯化OECs且在第12天通过免疫染色计数OECs纯度为85%。将IKVAV多肽纳米纤维支架凝胶与OECs复合培养, 倒置显微镜下观察OECs生长良好, Calcein-AM/PI活、死细胞染色表明活细胞数达95%。CCK-8法间接细胞计数证实IKVAV多肽可促进OECs的黏附, 对OECs增殖没有影响。由此可见IKVAV多肽可以自组装成纳米纤维支架凝胶且对OECs有良好的生物相容性及黏附作用, 可作为神经组织工程支架材料。     

MC 3T3-E1细胞在纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架上的增殖和分化

用原位合成纳米羟基磷灰石的方法制备多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架;在支架上接种MC3T3-E1细胞,瑞氏染色检测细胞形态,MTT法检测其增殖情况;在诱导培养基中培养30d后,碱性磷酸酶染色比较其分化水平;定量检测细胞的碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测成骨相关基因的表达情况。实验结果表明:MC3T3-E1细胞在纳米级羟基磷灰石/壳聚糖复合支架上粘附铺展良好,其增殖率显著高于培养于纯壳聚糖支架上的细胞。碱性磷酸酶染色表明复合支架上的细胞有较高水平的碱性磷酸酶表达。进一步定量检测细胞的碱性磷酸酶活性,结果说明在复合支架上细胞比纯壳聚糖支架上培养的细胞碱性磷酸酶活性提高了约8倍。此外,骨分化相关特征基因骨桥蛋白OPN在复合支架上培养的细胞中的表达水平也明显高于纯壳聚糖上培养的细胞。分化成熟标志基因骨钙素OC在复合支架上培养的细胞中有表达,但是纯壳聚糖支架上培养的细胞中却未检测到。支架中纳米羟基磷灰石的加入不仅提高了前成骨细胞在复合支架上的增殖,而且还促进了它的分化。纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架表现出良好的生物相容性和生物活性,是极具前景的骨组织工程支架材料。     

MC 3T3-E1细胞在纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架上的增殖和分化

用原位合成纳米羟基磷灰石的方法制备多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架;在支架上接种MC 3T3-E1细胞,瑞氏染色检测细胞形态,MTT法检测其增殖情况;在诱导培养基中培养30d后,碱性磷酸酶染色比较其分化水平;定量检测细胞的碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测成骨相关基因的表达情况。实验结果表明：MC 3T3-E1细胞在纳米级羟基磷灰石/壳聚糖复合支架上粘附铺展良好,其增殖率显著高于培养于纯壳聚糖支架上的细胞。碱性磷酸酶染色表明复合支架上的细胞有较高水平的碱性磷酸酶表达。进一步定量检测细胞的碱性磷酸酶活性,结果说明在复合支架上细胞比纯壳聚糖支架上培养的细胞碱性磷酸酶活性提高了约8倍。此外,骨分化相关特征基因骨桥蛋白OPN在复合支架上培养的细胞中的表达水平也明显高于纯壳聚糖上培养的细胞。分化成熟标志基因骨钙素OC在复合支架上培养的细胞中有表达,但是纯壳聚糖支架上培养的细胞中却未检测到。支架中纳米羟基磷灰石的加入不仅提高了前成骨细胞在复合支架上的增殖,而且还促进了它的分化。纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架表现出良好的生物相容性和生物活性,是极具前景的骨组织工程支架材料。     

颌下腺导管细胞与胶原海绵细胞相容性的实验研究

为探讨胶原海绵对颌下腺 (submandibulargland ,SMG)导管细胞的细胞相容性 ,采用HE染色光镜观察及免疫组化观察SMG导管细胞接种于胶原海绵后 ,细胞的生长情况。光镜下可见接种后第 1d细胞数量较少 ,分散于胶原海绵支架中间 ,第 7d细胞数量明显增加 ,免疫组织化学染色抗IV型胶原抗体染色呈阳性 ,说明细胞与支架材料之间已经有细胞外基质产生。胶原海绵具有良好的细胞相容性 ,是一种理想的支架材料。与胶原海绵复合培养 ,颌下腺导管细胞仍可保持良好的增殖能力。     

骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖支架制备及生物性能研究

目的:制备骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖复合多孔支架,观察支架生物性能。方法:采用冷冻干燥法制备骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖多孔支架。用光学显微镜和扫描电子显微镜观察支架表面形貌及孔径大小,用比重瓶法检测支架孔隙率,热重分析探讨支架的热稳定性,用微力试验机进行压缩性能测试,并将支架与兔骨髓间充质干细胞共培养检测细胞黏附性能,将支架埋置大鼠皮下观察其炎症反应。结果与结论:制备的骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖支架孔径大小为100~300μm,孔隙率为91.64%,压缩应力达3.37MPa,与细胞共培养贴附较好,有良好的组织相容性,提示该支架可做为组织工程支架材料应用于临床上骨组织缺损的修复。     

担载神经生长因子(NGF)的乳液法涂层纤维体外缓释研究

目的:目前周围神经修复中,神经导管是研究热点,本文研究乳液法涂层纤维制备的神经导管在神经修复中应用的可能性。方法:本文采用乳液法制备担载NGF的丝素-聚乳酸(PLLA)涂层电纺纤维,观察纤维的形态,测定NGF的体外释放动力学参数,并考察纤维释放液对于PC12细胞增殖的影响。结果:担载NGF的涂层纤维具备类似于细胞外基质(ECM)的三维结构和多孔形态;涂层纤维中NGF体外有效缓释10天;细胞实验中,在含有释放液的培养基中生长的PC12细胞,与空白对照组相比,荧光强度平均多了2000-4000个荧光强度,所以释放液可以更好地促进PC12细胞的增殖。结论:担载NGF的乳液法涂层纺丝纤维具备促进缺损周围神经修复的条件,可以进一步研究在动物体内修复缺损周围神经中的效果,为以后的临床应用打下基础。     

可控多孔结构支架制备及灌注式体外培养

利用CAD和快速成形技术设计制造具有可控多孔结构的支架。构建灌注式生物反应器系统,实现氧气和营养物质的大量输送,同时产生一定流体剪应力,调节细胞功能的发挥。根据支架负型结构制造出相应的树脂原型,用磷酸钙骨水泥进行填充烧结,得到与设计相符的多孔支架。接种兔成骨细胞,分别采用静态和灌注式三维动态培养方法,观察不同培养条件下细胞在支架表面以及所构造微管道内的生长情况。试验结果表明,灌注式体外培养方法更有利于细胞在支架微管道内的存活和功能的发挥,此灌注式系统能够改善支架微管道内细胞生存的微环境,增强黏附在支架微管道内细胞的活性,促进细胞进一步的增殖和矿化基质的产生。     

胶原蛋白-壳聚糖支架的构建及其与骨髓基质干细胞复合的实验研究

目的:构建一种组织工程神经支架,并观察体外培养的骨髓基质干细胞在其内部的生长情况,为后续种子细胞的移植提供阶段性实验数据.方法:以Ⅰ型胶原蛋白和壳聚糖为原料通过冷冻干燥技术制备神经支架,扫描电镜观察其内部结构,测量其孔径大小、孔隙率等指标.将体外培养的骨髓基质干细胞与Ⅰ型胶原蛋白-壳聚糖神经支架复合,共培养2天;扫描电镜观察细胞在支架内部的生长情况.结果:构建的神经支架均为圆柱状,内部为纵向平行排列的孔径均匀的微管样结构,细胞紧密贴附在支架微孔内壁上,细胞生长状况良好.结论:Ⅰ型胶原蛋白-壳聚糖支架具有良好的内部三维结构和生物相容性,可与细胞复合后用于修复周围神经缺损.     

天然高分子复合人工肌腱组织细胞外基质的构建与表征

胶原与壳聚糖是2种具有较好生物相容性和一定力学强度的天然高分子,可在肌腱组织工程中用于细胞外基质的构建,但二者单独使用时各有不足.本研究利用二者性能上的互补,在一定的外力场作用下,采用EDC/NHS对2种天然高分子材料进行共价交联,获得具有一定空间取向和力学强度的多孔支架,然后引入细胞黏附因子RGD进行表面修饰,构建了具有较好组织相容性和细胞亲和性及适当降解速率的人工肌腱组织细胞外基质.对基质材料的力学性能、亲水性、体外降解速率等的检测和显微观察,结果显示:所构建的多孔支架材料柔软富有弹性,抗拉强度达:15.0Mpa,相应形变为:7.33%;孔隙率:79.4%;吸水率:772%;保水率:206%;在RPM1640培养液(含10%胎牛血清)和人血清中,3周总降解率分别为4.13%和37.2%,其降解速率可与肌腱修复周期相吻合,RGD修饰后材料对3T3-L1细胞具有较好的亲和性.有望成为理想的人工肌腱组织和人造皮肤细胞外基质,或整形手术的软组织填充材料.     

前列腺癌DU145细胞相关蛋白在构建体内三维空间模型中的表达研究

目的探讨前列腺癌相关蛋白在胶原、琼脂糖、基质胶、海藻酸钠加明胶4种支架材料培养的前列腺癌DU145细胞中的表达水平。方法将前列腺癌DU145细胞按照一定比例接种至胶原、琼脂糖、基质胶、海藻酸钠加明胶4种支架材料中,分别分组进行移植瘤模型的三维培养,然后采用免疫组化方法检测MMP9、FN1、Laminin等3个前列腺癌相关蛋白在3种支架材料中培养的DU145细胞构建移植瘤模型后培养的组织中表达情况。结果 MMP9在有支架材料培养的前列腺癌DU145中蛋白表达高于无支架材料培养的组织;FN1在海藻酸钠加明胶组中蛋白表达阴性,在琼脂糖与胶原组中蛋白表达阳性且明显强于空白组;Lamininm在空白组与海藻酸钠加明胶组中均表达阳性,但明显低于胶原、琼脂糖、基质胶组的强阳性。结论采用支架材料的三维培养体系优于无支架材料的二维培养体系。胶原为体内前列腺癌DU145细胞三维培养的最优支架材料。     

锶纳米纤维能促进骨组织再生

为了探究锶纳米纤维在骨组织再生中的作用机制,本研究通过静电纺丝来制备聚合物纳米复合材料工程支架,促进骨组织再生。将碳酸锶纳米粒子(nSrCO3)以10%和15%重量比添加到聚己酸内酯(PCL)中,做成纤维直径在300～500 nm范围内的纳米复合材料纤维支架(PCL+10%SrCO3和PCL+15%SrCO3),掺入nSrCO3后降低了纤维支架的结晶度和弹性模量,复合PCL+15%SrCO3支架可在4 d内释放出高达58 ppm的Sr2+离子。细胞研究证实,体外使用的含有15%n Sr CO3的复合支架增强了人间充质干细胞的增殖。在PCL+15%SrCO3中,最小沉积量显著增加达约4倍,促进了骨形成。在PCL+15%SrCO3纤维中,成骨标志物如BMP-2和Runx2的mRNA和蛋白的高表达也可以证明锶纳米纤维能促进骨形成。本研究为研究锶纳米纤维在促进骨组织再生中的运用提供了一定的参考价值。     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的采用倒置显微镜、扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜（（laser scanning confocal microscopy,LSCM））技术对大鼠颌下腺细胞（rat submandibular gland cells,RSMGs）与丝素-壳聚糖（silk fibroin-chitosan,SFCs）的体外复合培养进行形态学观察。为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持。方法取0～8 d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体（CK8）及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜（5×5×2）mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构。将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况。结果倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行。SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构。经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞。荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内。LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息。结论四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测。LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值。     

PLGA的不同组成对支架材料性能的影响研究

研究PLGA的不同组成对支架材料的力学性能、降解性能和生物学性能的影响。采用溶液浇注/颗粒沥取法制备出不同组成的PLGA多孔支架,对支架的力学性能和降解速率进行考察,同时将人真皮成纤维细胞接种于不同组成的PLGA支架材料上,培养不同时间后,检测细胞的粘附率和增殖率,以及细胞产生的总胶原含量,并通过扫描电镜观察支架上的细胞形态。结果显示,随PLA比例的增加,支架的力学强度增加,降解速率降低,但都不是线性变化。70:30比例的支架,拉伸强度最高,而70:30和80:20两种比例的支架,其降解速率没有显著性差异。PLGA不同组成的支架,均具有良好的细胞相容性,成纤维细胞粘附率和增殖率在三种比例的支架上没有显著性差异,细胞在支架表面生长良好,分泌大量的细胞外基质,细胞基本铺满整个支架。本文研究发现,PLGA的组成对支架力学性能、降解性能和生物学性能有细小但显著的影响,这将对组织构建选用PLGA支架材料提供有益的帮助。     

基于不同仿生纤维密度的细胞响应行为研究

在组织再生中,电纺纤维具有仿生天然细胞外基质(ECM)纤维结构的优势,可为理解细胞对其生存微环境的动态重塑过程提供理想的研究平台,但常规电纺纤维膜的致密性带来的纤维间横纵交叉相互牵掣问题,最终导致其作用与表面呈纳米纤维状拓扑结构的实体材料类似,因而不能“精准”了解细胞对仿生纤维微环境的重塑作用.该研究通过控制电纺纤维的...     

移植BMMSCs-蚕丝蛋白生物支架对急性大鼠脊髓半切损伤修复的影响

目的:以蚕丝蛋白支架(silk fibroin porous scaffolds SFPS)接种骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)移植入SD大鼠脊髓半切损伤模型内,观察BMMSCs-SFPS复合生物支架对损伤脊髓的修复作用.方法:密度梯度离心法提取、贴壁法培养BMMSCs,取第三代对数生长期细胞,采用注射法制备BMMSCs-SFPS复合支架,复合14天进行生物相容性检测.40只SD大鼠复制脊髓半切损伤模型后随机分配为四组(n=10):A组BMMSCs-SFPS联合移植、B组单独移植BMMSCs、C组单独移植SFPS、D组为空白对照组,移植后分别于1、2、3、4周进行运动功能评分和术后4周进行HE染色观察、免疫荧光检测.结果:BMMSCs-SFPS复合支架体外培养14天后,扫描电镜可见BMMSCs附于SFPS支架内表面生长,细胞贴附良好并互有接触.移植入脊髓半切损伤模型后4周进行HE染色,结果显示A组脊髓空洞较其余三组小,免疫荧光检测结果示A组NF200、Nestin阳性表达高于B、C、D组,A组GFAP表达则明显低于其余三组.A组术后2～4周Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)评分均高于同期B、C、D组,比较差异有统计学意义(P＜0.01),D组评分明显低于同期其他3组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:BMMSCs-SPFS具有良好生物相容性,复合支架保证BMMSCs的存活数量、能抑制胶质瘢痕.BMMSCS-SFPS复合生物支架能发挥协同作用,促进脊髓半切损伤的大鼠运动功能恢复.     

自组装多肽纳米纤维支架诱导骨髓间充质干细胞定向分化

组织工程是现代修复重建医学领域的新思路,生物支架和种子细胞是组织工程两大关键要素。自组装多肽纳米纤维支架(SAPNS)是两亲性多肽(PAs)分子在一定条件下自组装成的一类具有三维网状结构的新型生物支架,其结构、生物功能、机械力学等特性类似天然细胞外基质(ECM),其内部经功能化修饰的抗原表位以高浓度呈递在纳米纤维表面并高效选择性地调控种子细胞生物学行为。种子细胞是组织成功再生的必需条件,骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其良好的自我更新和多向分化潜能成为了组织工程最佳候选细胞。体外实验表明经特异功能化修饰的SAPNS在有/无辅助因子条件下可促进BMSCs黏附、增殖、迁移和定向分化,动物模型体内实验发现SAPNS结合BMSCs构建的组织工程移植物可修复缺损部位的组织结构和功能,故其在修复重建医学中有良好的应用前景。对SAPNS、自组装、BMSCs、SAPNS诱导BMSCs定向分化等方面进行了综述。     

用于组织工程软骨支架的改性水凝胶初步筛选

目的:本研究对水凝胶材料加入不同复合成分进行改性后,通过细胞在材料表面的生长增殖情况,筛选适宜作为组织工程软骨支架的复合材料。方法:PEGD水凝胶中分别以8:2和6:4两种比例复合NVP或HEMA;大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)接种到改性后的复合材料表面共培养。以扫描电子显微镜(SEM)观察细胞在复合材料表面的生长状况。根据SEM观察结果,选择适宜的复合材料成分及比例,分别以等离子处理、丙烯酰胺接枝、真空干燥法和冻干法处理材料表面,再次接种MSCs,并以扫描电镜观察细胞生长;适宜材料在接种细胞前后的抗压强度也进行了评价。结果:根据SEM结果,(8:2)的PEGDA/HEMA和PEGDA/NVP表面完全无细胞生长;而在6:4比例的PEGDA/HEMA和PEGDA/NVP材料表面MSCs都有生长,其中以PEGDA/HEMA细胞增殖更明显。选择(6:4)PEGDA/HEMA复合材料分别进行三种方式表面处理,MSCs接种后在各种表面处理方式的材料都有生长,但以等离子处理后的材料表面细胞生长最旺盛,形态最好。细胞在(6:4)PEGDA/HEMA表面复合培养前后,材料的抗压强度没有统计学意义上的显著差别(P0.05)。结论:PEGDA/HEMA(6:4)具有良好的细胞相容性,尤其经等离子处理表面后细胞生长更优,可以作为组织工程软骨的支架材料。     

聚己内酯静电纺丝纳米纤维支架用于小鼠诱导多能干细胞培养

干细胞联合生物支架材料体外构建功能性组织与器官,成为当前组织再生研究的重要策略,而探求具有良好生物相容性的支架材料是其关键.本研究采用扫描电镜、噻唑蓝（MTT）法、荧光显微染色等方法检测小鼠诱导多能干细胞（murine induced pluripotent stem cells, miPSCs）在聚己内酯（poly ε-caprolactone, PCL）静电纺丝纳米纤维支架上的粘附、增殖等生物学特性,探究聚己内酯纳米纤维支架与miPSCs的生物相容性. 结果显示,miPSC在PCL纳米纤维支架上具有良好粘附性并呈集落样生长,其增殖能力及干性标记物（Oct4-GFP+）的表达均不亚于标准对照组;扫描电镜显示,miPSC在PCL纳米纤维支架材料上呈现出绒毛状突起的表面结构.上述结果表明,PCL纳米纤维支架可促进miPSCs的粘附、自我增殖以及干性维持,两者具有良好的生物相容性,为下一步联合生物支架材料与干细胞构建功能性组织奠定了基础.     

离心粘结法制备孔隙连通的三维细胞支架

目的:改进多孔支架制备技术,使多孔支架具有孔隙结构均匀、孔隙连通性良好的特性。方法:间歇离心技术与湿度粘结方法结合,改善致孔剂粘结的均匀性;溶液浇注/颗粒沥析技术制备三维多孔细胞支架;扫描电镜观察支架的孔隙结构,原子吸收光谱检测致孔剂残余,力学实验仪与重量法表征支架的其它物理性能与制备条件的关系。结果:三维多孔支架的孔隙呈球形、分布均匀、孔隙相互连通、通道呈规则的圆形;支架中无残余致孔剂。以聚乳酸为原料制备的支架,其孔隙率、压模量、吸水率分别高达94.7±0.5%、509±6kPa、208.2±20.3%。结论:间歇离心粘结--溶剂浇注/颗粒沥析技术,能够制备出孔隙结构均匀、孔隙相互完全连通的三维细胞支架,支架的孔隙大小和通道尺寸人为可控,支架的孔隙率和强度高,孔隙结构符合组织工程的要求,是一种比较理想的三维细胞支架制备方法。