基于PCR的基因差异表达分析技术

基因差异表达分析是研究许多生物学过程的分子基础的一条直接、有效的途径。自DDRT-PCR技术建立以来,一系列基于PCR的基因差异表达分析技术,如SAGE、SSH、RDA和DNA微阵列等相继发展起来,为分析和克隆差异表达的基因提供了更为快速、灵敏的工具。本对这几种方法进行了简要综述,比较了不同方法的优缺点,并展望了今后基因差异表达研究技术的发展方向。     

基因差异转录表达验证方法研究进展

基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关,随着对组织、器官分化及细胞、生物个体生长发育等的深入研究,大量差异转录基因的验证分析变得越来越重要。为此,该领域基于核酸互补配对和PCR原理建立了Northern blot和荧光定量PCR等一系列基因差异转录分析技术,利用这些方法对不同处理、不同组织器官、不同发育时段的基因差异转录进行了验证分析,为后续的基因功能分析奠定了坚实基础,并且通过检测分析,使基因差异表达分析方法由定性到定量、由繁琐复杂到简单快速、由以大量RNA为前提到对少量RNA样品的检测,甚至建立了单细胞荧光定量PCR方法,基因差异转录验证方法正在向更高效、精准方向发展,并使成本逐步降低。但是,到目前为止,生殖细胞等样品取样较为困难、精子等RNA含量较少样品的基因差异表达验证挑战性还仍然很大。从验证方法发展历程的角度,对基因差异转录验证方法进行了总结,希望为取样难度较大、RNA含量较低样品的基因差异表达分析提供有价值的参考。     

植物基因cDNA克隆新技术及进展

过去人们对植物基因的cDNA克隆主要集中在植物看家基因 (house keepinggene) ,而对植物发育调控基因 (developmentalregulatedgene)进行的cDNA克隆研究工作开展得比较少。随着近年来基因差异表达研究技术的飞速发展 ,已建立了好几种发育调控基因的cDNA克隆方法 ,如从较早的DD PCR到最近的cDNARDA、SSH和IPGI,着重论述了cDNARDA、SSH和IPGI的基本技术策略 ,并对三者之间进行了比较分析。     

生物信息学基因表达差异分析

基因的差异化表达由多种因素共同导致,并且与许多疾病的发生和发展有密切联系,对差异化表达的基因进行生物信息学以及生物统计学的分析对于研究细胞调节机制和疾病机理有着重要意义。目前,对差异化表达的基因有以下几种主流的研究方法：DNA微阵列（DNA microarray）,抑制性消减杂交（SSH）,基因表达连续性分析（SAGE）,代表性差异分析（RDA）,以及mRNA差异显示PCR（mRNA DDRT-PCR）。目前许多基因差异化表达数据是建立在时段（time series）基础上,因此对基于时间变化的基因差异化表达分析变得尤为重要。本文将对差异化表达基因的几种主流方法进行详细阐述,并介绍一种基于傅里叶函数的时段基因差异化表达分析。     

cDNA RDA在类似普通2型糖尿病大鼠肾脏组织基因差异表达筛查中的应用

应用代表性差异分析 (cDNARDA)技术 ,对类似普通 2型糖尿病大鼠肾脏组织基因差异表达进行筛查 ,初步探讨类似普通 2型糖尿病大鼠肾脏损害发病的分子机制 .首先以类似普通 2型糖尿病大鼠肾脏组织作为实验组 (Tester) ,正常大鼠肾脏作为对照组或驱动组 (Driver)通过cDNARDA进行基因差异表达筛查 ;最终的差异产物亚克隆到Puc 18载体 ,测序及并进行生物信息学分析 ;半定量RT PCR对筛查到新的基因进行初步的鉴定 .结果发现 9个新ESTs ,2个新基因 .这 2个新基因分别与人及小鼠的丝氨酸蛋白酶抑制因子F ,及真核细胞转录启动因子 3亚单位 5 (EIF 3epsilon)基因有高度的相似性 (>90 % )并在类似普通 2型糖尿病大鼠肾脏组织表达上调 .推测 2个新基因分别是大鼠的丝氨酸蛋白酶抑制因子F及真核细胞转录启动因子 3亚单位 5 .两个新基因在类似普通 2型糖尿病大鼠肾脏组织表达上调 ,可能与类似普通 2型糖尿病大鼠肾脏损害相关 .同时 ,对新基因RS91进行了全长cDNA克隆     

小麦抗黄矮病相关基因cDNA-AFLP差异表达片段的验证

cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达的有利工具,广泛用于植物抗病、抗逆和生长发育等研究领域.本研究以cDNA-AFLP技术分离的抗黄矮病小麦与感黄矮病小麦间差异表达片段为对象,利用反向Northern方法,从cDNA-AFLP技术筛选的46个候选抗黄矮病防御基因差异表达片段中,筛选出抗黄矮病相关防御基因片段6个;采用对回收的差异片段进行再扩增(延伸引物再扩增),再与原选扩产物一起进行PAGE电泳分析法,并结合半定量RT-PCR分析法,又验证了候选抗黄矮病相关基因表达片段3个.反向Northern方法以及对回收的差异片段进行再扩增(PAGE再分析法),结合(半)定量RT-PCR分析方法,可以比较准确地验证cDNA-AFLP所筛选出的基因差异表达片段.     

运用多种策略改良差异显示PCR

目的：改进差异显示PCR技术,提高其在筛选差异表达基因方面的效率。方法：①采用单碱基金铆钉引物;②增加引物长度;③提高PCR反应的严谨性;④应用同步重复测序电泳。结果：减少经典方法的工作量,降低了非特异性和假阳性率。用改良技术研究热适应大鼠下丘脑基因的差异表达,发现了一个差异表达基因片段,斑点杂交证实为阳性片段。结论：改进后的差异显示PCR技术是一种研究基因差异表达从而发现新基因或基因新功能的有效方法。     

长PCR技术及其在动物学研究中的应用

长PCR(1ongPCR)技术自194年发明以来,在生命科学发展中发挥了巨大的作用。长PCR技术与常规PCR有较大的区别。本文从长PCR技术的由来、长PCR技术对模板、引物和聚合酶的特殊要求及长PCR技术反应条件等方面进行了较全面的介绍。最后介绍了近期发展的LR-IPCR(long range-inverse PCR,长反向PCR)、内切酶介导性长PCR(endonuclease-mediated long PCR)、long RT-PCR以及LDD-PCR。目前此技术在动物学研究中的应用主要在基因组测序和线粒体基因组研究、病理诊断、基因差异表达、病原微生物的研究、遗传多态性分析等领域。     

干旱胁迫下发菜光合作用相关基因差异表达分析

该研究以不同失水处理的发菜为研究材料,以充分吸水状态的发菜为对照,利用高通量测序技术和qRT PCR技术检测了干旱胁迫下发菜光合作用相关基因差异表达规律,并对光合色素和酶活在干旱胁迫下的变化进行了研究。结果表明：(1)发菜在不同程度干旱胁迫下有113个光合作用相关基因差异表达,其中失水30%、75%和100%的发菜分别有44个、74个和91个光合作用相关基因差异表达。(2)随着干旱胁迫程度的加深藻胆素、叶绿素a和类胡萝卜素含量逐渐降低,Rubisco活性随着干旱胁迫程度的增强先上升后下降,GAPDH活性随着干旱胁迫的增强呈现下降的趋势。研究表明,发菜通过光合作用相关基因的差异表达调控光合作用以适应干旱胁迫。该研究结果对进一步研究发菜干旱胁迫响应机制及其耐旱光合机理奠定了基础。     

苜蓿雄性不育系MS-4 SSH文库构建及基因表达分析

以苜蓿雄性不育系MS-4与可育系花蕾为材料,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,分别构建了不育条件下和可育条件下基因差异表达消减cDNA文库,在2个库中分别随机挑选阳性克隆进行测序,经序列比对分析,共获得功能已知的EST序列190条。后经GO功能分类,对推定出的6个相关基因进行荧光定量PCR分析。结果表明:6个基因在苜蓿雄性不育系花蕾不同发育时期中均出现差异表达,推测这6个基因可能与苜蓿雄性育性相关,并且在其育性转换中具有重要作用。     

RAP—PCXR技术及其应用

RAP－PCXR是以PCR为基础构建RNA指纹图谱,研究基因差异表达的有效方法,所显示的种系特异性差异可用于对基因的遗传作图,所揭示的组织特异性可用于研究特异基因的表达。该法可检测各种情形下RNA群体间的差异。本简介其基本原理及在基因差异表达研究领域的最新应用。     

基于mRNA水平的差异表达基因筛选技术

随着分子生物学技术的深入发展,基因组研究重点已经由基因组测序转向基因功能鉴定,即由结构基因组学向功能基因组学转变。研究获得不同处理下基因的差异表达谱是功能基因组学的重要一环,目前已经有多种检测基因差异表达的技术可供选用。在减法杂交技术和PCR基础上发展起来的DDRT—PCR、cDNA—RDA、cDNA—AFLP和SSH技术因其实用性而得到广泛的应用,并取得了令人满意的结果。     

抑制性消减杂交技术的应用

基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容.在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH)技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中.近年来,抑制性消减杂交(SSH)技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展.主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述.     

利用单酶切cDNA—AFLP技术分离玉米对生性状相关基因差异表达片段

为了深入地研究对生玉米这一珍贵的高产育种种质资源和植物形态发育突变材料形成的分子机理和调控机制,通过构建合适的玉米对生、互生近等基因系总RNA池,首次采用改进的单酶切cDNA-AFLP技术,对扩增的玉米对生性状相关基因的差异表达片段进行筛选、分离和生物信息学分析.结果共获得29条差异表达片段:对生玉米增强表达23条、抑制表达6条.选取其中5条(STT-TT、STT-TC、STT-CC、STT-GC、SCT-TG)增强表达片段进行克隆和测序,序列同源性分析表明:STT-GC与烟草细胞色素b5基因有80%的同源性、SCT-TC与玉米、牛筋草、大麦、狗尾草、水稻等的α-微管蛋白基因有90%以上的同源性.实验证明:单酶切cDNA-AFLP技术是一种研究玉米基因差异表达的实用方法.     

哺乳动物转录因子DNA结合谱

基因差异表达是生物发育和对刺激作出应答的分子基础,转录因子在这种基因差异表达中发挥着重要的调控作用。因此,要弄清楚转录因子调控基因差异表达的机理,就必须鉴定出它们全部的靶基因并构建其操纵的转录调控网络。对基因组DNA的序列特异性结合是转录因子调控基因转录的关键环节,因此,要鉴定转录因子的靶基因,就必须从它们与DNA相互作用的分子水平,鉴定它们能够识别并结合的全部DNA序列,即转录因子DNA结合谱。近年来随着DNA微阵列芯片和高通量DNA测序技术的产生和快速发展,出现了建立转录因子体内及体外DNA结合谱的一系列革命性的新技术,对该领域的研究带来重大影响。这些新技术主要包括建立转录因子体内DNA结合谱的染色质免疫沉淀-芯片技术(ChIP-chip)和染色质免疫沉淀-测序技术(ChIP-Seq),以及建立转录因子体外DNA结合谱的双链DNA微阵列芯片技术(dsDNA microarray)、指数富集配体系统进化-系列分析基因表达技术(SELEX-SAGE)、结合-n-测序技术(Bind-n-Seq)、多重大规模并行SELEX技术(MMP-SELEX)、凝胶迁移实验-测序技术(EMSA-Seq)和高通量测序-荧光配体互作图谱分析技术(HiTS-FLIP)。文章将对这些新技术做一综述。     

NaCl胁迫下宁夏枸杞光合作用相关基因差异表达分析

宁夏枸杞是著名的耐盐药用植物,该研究通过室内水培试验,利用高通量测序技术和qRT-PCR技术检测了不同浓度NaCl胁迫(0、100、200、300 mmol/L)下宁夏枸杞叶片光合作用相关基因差异表达,并分析了其叶绿素含量、净光合速率、Rubisco活性的变化,以揭示宁夏枸杞在盐胁迫条件下光合机构及光合作用相关基因差异表达规律,为深入解析宁夏枸杞响应盐胁迫的光合机理奠定基础。结果表明：(1)用100、200、300 mmol/L NaCl胁迫处理7 d时宁夏枸杞分别有14、26、55个光合作用相关基因差异表达,且随着NaCl胁迫程度的增加下调表达基因多于上调表达基因。(2)qRT-PCR结果显示,宁夏枸杞的3个光合作用相关基因ATPε、CLH2、Lhcb3的相对表达量均随着NaCl胁迫程度的加深总体呈显著下降的趋势,qRT-PCR验证结果与RNA-seq测序结果基本一致。(3)随着NaCl胁迫程度的增加,宁夏枸杞叶片中的叶绿素a和叶绿素b含量以及净光合速率和Rubisco活性均呈显著下降的趋势,而类胡萝卜素含量变化不显著。研究认为,宁夏枸杞能通过诱导光合作用相关基因的差异表达来调控叶片...     

一株MAs(Ⅲ)脱甲基菌株的分离及功能基因的研究

【目的】分离并鉴定三价单甲基砷(MAs(Ⅲ))脱甲基菌株,对MAs(Ⅲ)脱甲基菌FJ-6中arsI基因进行克隆表达,并对arsI基因表达蛋白进行功能鉴定。【方法】利用富集培养的方法分离MAs(Ⅲ)脱甲基菌株,并通过形态学、生理生化特征和16SrDNA基因进化分析进行鉴定;HPLC-ICP-MS鉴定菌株转化MAs(Ⅲ)的产物为三价砷(As(Ⅲ)),对菌株FJ-6的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的MAs(Ⅲ)脱甲基酶编码基因,通过PCR扩增获得arsI全长基因,构建重组质粒pET29a-arsI,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化异源表达的蛋白,以MAs(Ⅲ)为反应底物,检测MAs(Ⅲ)脱甲基酶ArsI的酶学特性。通过实时定量PCR观察arsI的表达类型。【结果】Bacillus aryabhattai FJ-6在12 h内能将1μmol/L MAs(Ⅲ)完全转化为As(Ⅲ)。克隆得到MAs(Ⅲ)脱甲基酶表达基因arsI,构建了pET29a-arsI重组质粒并进行了表达,ArsI蛋白分子量为17.4 kDa。ArsI纯化蛋白具有较高的MAs(Ⅲ)脱甲基酶的活性;荧光定量PCR实验结果表明arsI受砷诱导表达。【结论】明确了ArsI蛋白具有MAs(Ⅲ)脱甲基酶活性。     

中外两品种鸡胸肌组织差异表达基因的研究

运用mRNA差异显示技术对北京油鸡和AA肉鸡胸肌组织基因的差异表达进行研究, 从分子水平分析导致两品种肌肉组织基因差异表达的机制。通过反向Northern dot blot技术验证共筛选出差异表达基因7条, 经与GenBank数据库进行相似性比对, S1与HMGN3基因有较高同源性; S3与ChEST294a8有很高同源性, 但功能未知; S4和S5与鸡的磷酸葡萄糖变位酶Ⅰ同源性很高; S6和S2与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高同源性, 为已知的EST, 但功能未知; 序列S7未在数据中发现同源序列, 可以确定其在AA肉鸡中特异表达,确定为新发现的EST(GenBank登录号: EU594549)。为进一步研究中外两品种鸡胸肌组织基因差异表达机制奠定了基础。     

差异表达基因克隆技术的进展

分离并克隆差异表达基因,不仅有助于揭示生命的奥秘,而且还能为基因诊断与治疗提供重要的理论依据。基因差异表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。以前,过多强调克隆新出现的表达基因,忽略表达量差异的基因。目前研究认为,表达量差异的基因...     

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。