光滑球拟酵母线粒体抵御乙偶姻胁迫的生理机制解析

以光滑球拟酵母为出发菌株,利用生化和分子生物学实验研究微生物抵御有机溶剂胁迫的生理机制。首先,添加柠檬酸盐考察能量供给对细胞抵御乙偶姻胁迫的影响。与对照条件(0 mmol/L柠檬酸盐)相比,50 mmol/L柠檬酸盐可使细胞生物量在不同乙偶姻质量浓度(6、10、12和15 g/L)胁迫下分别提高了13.2%、14.2%、17.8%和25.2%。同时,通过表达线粒体融合分裂调控基因fzo1和dnm1,以细胞活力、胞内活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)为研究指标考察调控线粒体融合分裂对乙偶姻胁迫的影响。结果表明:与对照菌株相比,在不同乙偶姻质量浓度胁迫下(12和18 g/L),增强线粒体融合可抑制胞内ROS的产生,使其水平分别降低了9.3%和16.2%;却使胞内ATP水平分别提高了9.7%和36.1%,从而延缓乙偶姻胁迫对细胞活力的影响,使细胞生物量相应地提高了9.1%和29.7%。因此,通过添加柠檬酸或改善线粒体生理功能以提高胞内能量供给,可有效提高微生物细胞抵御乙偶姻等环境胁迫的能力。     

光滑球拟酵母新霉素抗性株加速葡萄糖代谢

为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的生产强度,在能量代谢分析的基础上提出了降低ATP合成酶活性、但不影响NADH氧化的育种策略。通过亚硝基胍诱变,获得一株新霉素抗性突变株N07,该菌株F1ATPase活性降低65%、丙酮酸产量高于48gL且单位细胞消耗葡萄糖能力提高38%。添加双环己基碳二亚胺(DCCD)、叠氮钠(NaN3)、新霉素显著降低出发株F1ATPase活性但不影响突变株F1ATPase活性。突变菌株胞内ATP含量下降23.7%导致生长速率和最终菌体浓度(为出发菌株的76%)均低于出发菌株,但葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度分别提高34%和42.9%,发酵周期缩短12h。进一步研究发现,突变株糖酵解途径中关键酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和磷酸甘油醛激酶的活性提高了63.7%、28.8%和14.4%,电子传递链关键酶活性提高10%。结果表明降低真核微生物F1ATPase活性有效地提高了糖酵解关键酶活性而加速葡萄糖代谢。     

蛋氨酸高产酵母突变株的推理筛选

以啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌株Ⅰ为出发株,经紫外线处理后,在含可完全抑制出发株生长的乙硫氨酸（浓度为2g/L）的基本培养从上筛出14株生长良好的突变株,其中I－2,I－9株还能在无硫基本培养基上良好生长。经氨基酸自动分析仪检测,I－2株菌体蛋白中的蛋氨酸含量（质量由分比）由I株的1．93增年9．28。     

降低光滑球拟酵母电子传递链活性加速丙酮酸合成

光滑球拟酵母CCTCCM2 0 2 0 19经溴化乙锭诱变 ,挑选假阳性呼吸缺陷型菌株共 4 0株。对其中 7株丙酮酸产量提高的突变株进行发酵性底物 (葡萄糖 )和非发酵性底物 (甘油、乙酸 )的利用能力测试 ,鉴定得到 3株呼吸缺陷型突变株RD 16、RD 17和RD 18。相对于出发菌株 ,呼吸缺陷型突变株生长速率下降 ,最终菌体浓度降低 2 1%～2 9% ,胞内ATP含量下降 15 %～ 2 1% ,但单位细胞耗葡萄糖能力和单位细胞产丙酮酸能力分别提高了 2 0 7%～30 7%和 30 7%～ 5 5 5 %。进一步研究发现 ,呼吸缺陷型突变株线粒体复合体Ⅰ、Ⅰ Ⅲ、Ⅱ Ⅲ和Ⅳ的活性分别下降了 34%～ 4 1%、38 6 %～ 5 2 6 %、2 1%～ 2 5 %、15 0 %～ 6 30 % ,表明线粒体电子传递链氧化NADH的功能受到抑制。为使酵解产生的NADH正常氧化 ,在RD 18菌株的对数生长期流加 2 1mmol L外源电子受体乙醛。发现细胞合成丙酮酸能力提高 2 1 6 % ,且葡萄糖消耗速度明显加快 ,发酵周期缩短 14h。结果表明适当削弱能量代谢能够提高真核微生物中心代谢途径的速度     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产乙偶姻的pH调控策略

【目的】为了提高Bacillus subtilis CCTCC M 208157发酵生产乙偶姻的效率。【方法】在7 L发酵罐水平上考察不同pH条件对菌株生长及乙偶姻合成的影响。【结果】pH对菌株合成乙偶姻有显著影响,pH 4.5有利于细胞合成乙偶姻,但是延迟期较长;pH 5.5时菌株生长较快,但乙偶姻的产量偏低。因此提出了两阶段pH控制策略:发酵前期(0 16 h),控制pH 5.5;发酵中后期(16 72 h),控制pH 4.5。【结论】通过此策略,菌株合成乙偶姻的能力得到进一步提高,乙偶姻的产量、产率和生产强度分别为32.7 g/L、0.41 g/g和0.91 g/(L.h),分别比初始发酵条件下提高了41%、42%和69%。     

丝孢酵母高甲硫氨酸突变株的选育及营养调控

以丝孢酵母(Trichosporon Behr)ST851为原始菌株,经紫外线诱变,在含乙硫氨酸的双层平板上筛选到多株抗乙硫氨酸突变株。其中ST851-10株抗乙硫氨酸浓度达到350μg/ml,其菌体蛋白质含量由40.5％提高到44.3％,菌体甲硫氨酸含量由20.45mg/g-DCW增加到29.32mg/g-DCW。在以苹果渣为碳源、尿素为氮源、硫酸镁作硫源的最适培养条件下,固态发酵24h后,蛋白质和甲硫氨酸含量较原始菌株分别提高了15.8％和44.9％。培养基中C/N值低有利于甲硫氨酸的合成,C/N值高则适合于菌体生长。在苹果渣固态发酵过程中,适当补加氮源既有利于菌体生长和甲硫氨酸的合成,又可起到调节培养基pH值的作用。     

两株高糖分利用能力的酿酒酵母呼吸突变体选育

以酿酒酵母乙醇发酵高产工业菌株MF1002为始发菌株,对其营养细胞进紫外线诱变,筛选得到两株性状稳定的呼吸缺陷型突变体MF15c和MF11a。菌体细胞对2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)显色测定呼吸强度的结果表明,两突变菌株的相对呼吸强度分别只有始发菌株的57.77%和47.25%。与现有报道的呼吸缺陷突变体不同,两株突变体的细胞生长速率只在培养初期略低于始发菌株,总体生长速率与始发菌株几乎没有差异,在YPD平板上培养也不形成小菌落。比较蔗糖发酵试验表明,两株突变体的乙醇产量较始发菌株只分别略提高6.48%-6.59%(MF15c)和1.66%-1.97%(MF11a),但发酵终止的残总糖含量却显著低于始发菌株,分别减少34.85%和19.70%,发酵效率较始发菌株分别显著提高6.69%和4.71%,表明这两株突变体为新型的呼吸缺陷型突变。鉴于提高乙醇发酵的发酵效率可显著降低生产成本,认为这两株突变菌株具有较高的潜在工业利用价值。     

HOG1 MAPK参与调控亚砷酸钠诱导的酵母细胞凋亡

【目的】本研究探讨了HOG1 MAPK在亚砷酸钠诱导酵母细胞凋亡中的作用。【方法】以酵母野生株BY4741及其HOG1突变株(ΔHOG1)为材料,研究了亚砷酸钠对酵母细胞生长、相对存活率和氧化损伤的影响,并采用流式细胞术检测了亚砷酸钠胁迫下酵母细胞凋亡率、ROS水平和线粒体膜电位的变化。【结果】亚砷酸钠可抑制酵母细胞生长,诱导细胞凋亡。在相同处理组中,ΔHOG1对亚砷酸钠更为敏感,表现为细胞存活率降低,凋亡率升高。在亚砷酸钠胁迫过程中,ΔHOG1胞内ROS水平和MDA含量显著高于野生株BY4741,而线粒体膜电位显著低于野生株。【结论】HOG1 MAPK可能通过影响胞内ROS水平和线粒体膜电位的变化调控亚砷酸钠诱导的酵母细胞凋亡。     

利用脂肪酸合成酶抑制剂和磷酸香草醛反应筛选高产油脂酵母菌

利用80 MeV/u碳离子束对产油菌株粘红酵母进行辐照诱变, 采用含有脂肪酸合成酶抑制剂cerulenin的培养基进行高产油脂突变株的初筛, 并通过磷酸香草醛反应和氯仿甲醇抽提法对初筛菌株油脂含量进行分析。结果表明, cerulenin对酵母细胞生长有较好的抑制作用, 浓度为8.96×10-6 mol/L时, 抑制率达98%以上, 可作为筛选浓度。通过磷酸香草醛反应法对初筛菌体油脂含量进行定量分析, 发现菌体油脂含量与该反应在530 nm处的光吸收成线性正相关, 初筛菌株的正突变率达65%以上。该方法快速方便, 是一种较为理想的产油酵母筛选方法。通过该方法, 筛选出了2株油脂含量高于对照90%以上的突变株。     

一株耐受高浓度葡萄糖且产乙偶姻菌株的筛选及产物鉴定

为获得一株耐受高浓度葡萄糖且产乙偶姻的菌株,利用高糖培养基以及乙偶姻显色液从烟田土壤中筛选到一株全新菌株;将筛选出的菌株利用全基因组测序技术和16S rDNA序列比对分析对菌株进行鉴定,并利用不同浓度葡萄糖的培养基对菌株进行耐受实验;最后,利用GC-MS(气相-质谱)将菌株的发酵产物定性分析,并对菌株进行72 h的初步发酵。结果显示,筛选获得菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),命名为PX03。葡萄糖耐受实验中,菌株PX03在含有500 g/L葡萄糖的培养基中依然能生长,OD600可达65;300 g/L葡萄糖浓度下生长最好,OD600可达100。GC-MS定性结果分析发现,该菌株可产大量的乙偶姻(22.51%)和2,3-丁二醇(21.29%),同时可产乙酸(13.97%)、3,4-二羟基-3,4-二甲基己烷-2,5-二酮(8.52%)、吡喃酮(5.24%)和3-甲基-丁酸(4.47%)等一些香气成分。对菌株的初步发酵结果显示,该菌株乙偶姻产量可达41 g/L。     

辅酶Q10产生菌的抗性筛选及发酵条件优化

以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)WSHAT12为出发菌株,通过硫酸二乙酯诱变,获得遗传稳定性好的抗L-乙硫氨酸(Eth)突变株WSH-E01,通过进一步的诱变处理,获得L-乙硫氨酸和维生素K3(VK3)双抗性突变株WSH-V01,以双抗性突变株WSH-V01为出发菌株,再进行诱变处理,获得一株X-gal利用能力提高的突变株WSH-X01,与出发菌株WSHAT12相比,突变株WSH-X01的辅酶Q10产量提高幅度达50.6%,同时,对突变株WSH-E01的发酵条件进行优化。出发菌株WSHAT12、突变株WSH-E01、WSH-V01和WSH-X01在优化后的发酵条件下辅酶Q10产量分别达到23.1mg/L、26.8mg/L、29.5mg/L和34.8mg/L。     

枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex对乙偶姻合成的影响

【背景】枯草芽孢杆菌体内含有一种可响应胞内氧化还原水平的因子,称之为氧化还原感应全局调控因子Rex (由基因ydiH编码)。Rex可通过感知辅酶NADH/NAD+水平的变化来调节胞内氧化还原平衡。【目的】研究Rex对枯草芽孢杆菌乙偶姻合成和辅因子代谢的相关性。【方法】利用比较转录组挖掘乙偶姻和2,3-丁二醇可逆转化过程中显著差异的基因,并通过Cre/lox基因敲除技术敲除ydiH、acuA (乙酰AcsA)和acoC (二氢脂酰胺乙酰转移酶)。随后,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析敲除菌株中乙偶姻相关基因的转录水平。【结果】通过发酵实验发现,敲除ydiH会在一定程度上抑制菌体的生长速率,但发酵前期乙偶姻单位细胞产量和底物转化率都得到了显著提高;敲除acuA和acoC后,对乙偶姻合成、菌体生长和糖耗速率均影响不大;敲除ydiH后,与乙偶姻合成相关基因alsR (alsSD的正转录调控因子)、alsS (α-乙酰乳酸合成酶)、alsD (α-乙酰乳酸脱羧酶)和bdhA (2,3-丁二醇脱氢酶)的转录水平显著上调。【结论】枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex通过抑制与...     

枯草芽孢杆菌HS-A38高产抗菌肽突变株的筛选及其抑菌机理的研究

本研究通过采用多种诱变方法以提高枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌肽能力,并研究诱变株产抗菌肽活性物质对副溶血弧菌的抑制作用机理。原始菌株经过多种复合诱变后,最终获得一株抗菌活性明显提高的诱变菌株(mut HS-301)。进一步研究采用双倍稀释法确定最低抑菌浓度,并通过扫描电镜观察、胞膜通透性和胞膜完整性的测定,初步阐述该抗菌肽的抑菌机理。结果表明:诱变菌株mut HS-301对副溶血弧菌的抑菌活性较原始菌株提高了20%;抗菌肽成品对副溶血弧菌的最低抑菌浓度为0.625 mg/m L;抗菌肽破坏了菌体细胞的形态,出现形变;随着抗菌肽作用时间的增加,胞外紫外吸收物质和胞外蛋白含量明显增加,说明抗菌肽影响了副溶血弧菌细胞膜的通透性,其胞膜的完整性遭到破坏,影响其代谢活性,从而抑制副溶血弧菌的生长。该研究表明,微生物产抗菌肽主要作用于细菌细胞膜,该产品适宜添加到水产动物养殖饲料中,对提高水产动物免疫力和预防疾病起重要作用。     

积累L-苹果酸的米根霉突变株酶活性初探

对富马酸产生菌株—米根霉ME-F10进行诱变育种的过程中, 得到一株性能稳定的高效积累L-苹果酸的突变株ME-M15。该菌株发酵96 h平均L-苹果酸产量达16.3 g/L, 较出发菌株L-苹果酸积累量平均提高3倍, 而富马酸和乙醇的积累量大幅下降。对突变株代谢途径关键酶活研究表明, 突变株富马酸酶胞质途径同功酶和乙醇脱氢酶活力较之出发菌株酶活力明显减弱, 而丙酮酸羧化酶活力无明显差别。     

苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株的特点

摘要：【目的】构建苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株,并研究其与出发菌株的表型及性质差异。【方法】采用基因同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中的spoIIID基因,构建了spoIIID缺失突变株,测定生长曲线,并通过扫描电子显微镜观察,芽胞计数分析及SDS-PAGE 蛋白电泳比较突变株与出发菌株的差异。构建遗传互补菌株,观察菌株性状的回复情况。【结果】通过温敏载体同源重组敲除技术获得了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株spoIIID基因缺失突变株,生长曲线测定表明,突变株较出发菌株在平稳期后期生长较缓和;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变株基本丧失了形成芽胞的能力,但依然形成晶体。SDS-PAGE结果显示,在 SSM培养基中,突变株对伴胞晶体蛋白的形成量影响并不显著;在营养较富集的Luria-Bertani培养基中,突变株中伴胞晶体蛋白的形成量较野生型和互补株明显降低。利用载体pHT315携带spoIIID操纵子互补突变株,互补株恢复了产生晶体和芽胞的能力。【结论】本研究证明spoIIID基因是苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,同时与晶体蛋白的表达相关。     

复合诱变选育高产GSH的菌株

目的:选育出GSH的高产菌株.方法:以产GSH的产朊假丝酵母(Candida utilis)为出发菌株,利用紫外-超声波复合诱变.结果:筛选得到ZnCl2抗性突变株UU3,GSH菌体含量为53.50mg·g-1,比出发菌株提高137.03%.结论:突变株UU3遗传性能稳定,可做进一步研究.     

枯草芽孢杆菌耐盐突变株proA基因克隆及proBA基因渗透压调节功能研究

利用TaKaRaLAPCRTM试剂盒扩增枯草芽孢杆菌 931 5 1耐盐突变株proA基因的未知下游序列。根据测序结果 ,设计引物 ,克隆出发菌株和突变株全长proBA基因。将出发菌株和突变株的proBA基因分别转化大肠杆菌JM83(proBA- ) ,均能够与其功能互补。SDS PAGE分析其表达产物 ,有两条分子量分别约为 4 0kD和 4 5kD的新蛋白带出现。测定 4种转化子 (分别含有出发菌株和突变株proB基因的大肠杆菌 1 1 2 5 2转化子及proBA基因的大肠杆菌JM83转化子 )的耐盐能力。发现含有突变株proB或proBA基因转化子的耐盐能力 ,均比相应的含有出发菌株proB或proBA基因的转化子高。另外含有出发菌株和突变株的proBA基因转化子的耐盐能力 ,也均比相应的仅含proB基因的转化子高 ,表明枯草芽孢杆菌的ProA比大肠杆菌的ProA更为有效。测定所有JM83转化子胞内自由脯氨酸 ,发现其含量随盐浓度的上升而提高 ,其中含突变菌株proBA基因的转化子提高更为显著     

枯草芽孢杆菌耐盐突变株proA基因克隆proBA基因渗透压调节功能研究

利用TaKaRa LA PCRTM试剂盒扩增枯草芽孢杆菌93151耐盐突变株proA基因的未知下游序列。根据测序结果,设计引物,克隆出发菌株和突变株全长proBA基因。将出发菌株和突变株的proBA基因分别转化大肠杆菌JM83（proBA\+-）,均能够与其功能互补。SDSPAGE分析其表达产物,有两条分子量分别约为40kD和45kD的新蛋白带出现。测定4种转化子（分别含有出发菌株和突变株proB基因的大肠杆菌1.1252转化子及proBA基因的大肠杆菌JM83转化子）的耐盐能力。发现含有突变株proB或proBA基因转化子的耐盐能力,均比相应的含有出发菌株proB或proBA基因的转化子高。另外含有出发菌株和突变株的proBA基因转化子的耐盐能力, 也均比相应的仅含proB基因的转化子高, 表明枯草芽孢杆菌的ProA比大肠杆菌的ProA更为有效。测定所有JM83转化子胞内自由脯氨酸,发现其含量随盐浓度的上升而提高,其中含突变菌株proBA基因的转化子提高更为显著。     

酿酒酵母Mbp1基因缺失突变株耐受性研究

为了研究Mbp1基因对工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)耐受性的影响,在敲除野生型工业酿酒酵母MF1015菌株Mbp1基因的基础上,分析Mbp1基因缺失菌株(突变菌株)与野生型在乙醇耐受性、耐热性、细胞壁完整性、呼吸强度、海藻糖含量、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙醇脱氢酶(ADH)活性等方面的差异。结果表明:在含刚果红或SDS的平板上突变菌株的菌落比野生型小、菌体存活率比野生型低;突变菌株的乙醇耐受性和耐热性均下降,在乙醇浓度为9%的液体培养基中,突变菌株的最大OD600约为3.15,而野生型最大OD600值约为3.48;在30℃和37℃时突变菌株和野生型的生长趋势基本一致,而在40℃时,突变菌株最大OD600约为3.0,而野生型约为4.5;用9%乙醇处理后,突变菌株胞内海藻糖含量、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、乙醇脱氢酶酶活分别比野生型低49%、80%、24%、37%、73%,而未经乙醇处理的突变菌株和野生型酶活无明显差别。推测Mbp1基因有助于工业酿酒酵母适应外部不良环境。     

高产虾青素红法夫酵母的选育及代谢通量分析

以野生型红法夫酵母As2.1557为出发菌株,依次进行两轮紫外线诱变和亚硝基胍诱变,并以10-4与10-3mol/Lβ-紫罗酮作为筛选剂,得到突变株UV-N2-7,其虾青素产量和含量分别较出发菌株提高81.7%和2.25倍。采用Plackett-Burman设计法及响应面分析法对发酵培养基的组分及发酵条件进行了优化,突变株的虾青素产量由从初始的2.674 mg/L提高到了6.338 mg/L。建立了红法夫酵母的代谢网络,并对比了突变株和野生株间歇培养条件下对数生长期的代谢通量分布。结果表明:突变株与野生株相比,PP途径通量有所减小,而EMP途径和TCA循环有所增强,突变株用于菌体生长的通量有所减小;二者的丙酮酸脱氢酶的活性均较低,分泌至胞外的丙酮酸的代谢通量约为32%。因此预计通过遗传改造和发酵控制提高丙酮酸脱氢酶的活性可能会进一步提高虾青素的产率。