全基因组预测禾谷炭疽菌的分泌蛋白

目的:禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等农作物引起的炭疽病,给农业生产造成了巨大经济损失。分泌蛋白在植物病原菌对植物侵染、定殖、扩展等致病过程中,发挥着重要作用。对禾谷炭疽菌分泌蛋白进行预测,并对其特征进行明确。方法:利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP预测程序对禾谷炭疽菌中120 006条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小、信号肽切割位点以及理化性质等进行分析。结果:禾谷炭疽菌含有分泌蛋白为630个,其氨基酸长度多集中于100~600 aa之间;信号肽长度以17~20个aa的序列最为集中;信号肽切割位点属于A-X-A类型;分泌蛋白在分子量、等电点、稳定系数方面均存在差异,但大多数分泌蛋白属于亲水性蛋白。此外,上述分泌蛋白中,具有预测功能的蛋白为330个,其功能较多的集中于酶类,包括α-半乳糖苷酶、β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等。结论:通过上述生物信息学分析方法有效地实现了禾谷炭疽菌分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点类型与已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉等分泌蛋白信号肽切割位点一致,分泌蛋白功能涉及较多的酶类,也与其他已经报道的病菌分泌蛋白功能相类似。     

立枯丝核菌AG-3全基因组分泌蛋白的预测分析

[目的]预测、分析立枯丝核菌AG-3全基因组范围内的分泌蛋白，并明确其基本特征，筛选其效应蛋白。[方法]依据已经公布的立枯丝核菌AG-3全基因组数据库中的12 726个蛋白序列，利用信号肽预测软件SignalP-4.1,细胞器定位分析软件ProtComp 9.0,跨膜螺旋结构预测软件TMHMM 2.0, GPI-锚定位点预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP-1.1进行典型分泌蛋白的预测分析，并用LipoP-1.0进行信号肽切割位点的预测分析，最后对预测得到的分泌蛋白通过EffectorP进行效应蛋白的预测。[结果]在立枯丝核菌AG-3中有401个蛋白被预测为分泌蛋白，其编码蛋白长度集中于100～600 aa。信号肽长度介于11～35 aa之间，-3至-1位置上的氨基酸相对保守，切割位点为A-X-A类型，可被SpⅠ型信号肽酶识别并切割。在预测得到的分泌蛋白中通过EffectorP筛选得到140个效应蛋白。[结论]通过全基因组预测得到401个具有典型分泌蛋白特征的蛋白，从预测的分泌蛋白中筛选得到140个效应蛋白。     

内生菌KM-1-2全基因组ORFs信号肽和分泌蛋白预测及功能分析

【目的】内生菌普遍存在于植物中,与宿主在长期的进化中形成了互利共生的关系。目前对内生菌和植物之间的互作机制研究较少,为深入了解银杏叶内生菌KM-1-2与寄主植物作用机制,本研究对其分泌蛋白进行预测,并明确其特征。【方法】组合使用信号肽分析软件Signal P,跨膜螺旋结构分析软件TMHMM 2.0和Phobius,蛋白质细胞定位软件PSORT,亚细胞定位软件Target P和GPI锚定位点分析软件big-PI Predictor,预测KM-1-2基因组范围内所有分泌蛋白,定义为分泌组。【结果】KM-1-2全基因组5299条蛋白序列中发现271个具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组的2.4%;编码这些蛋白的ORF最短为61 bp,最大为2105 bp,平均为373 bp;引导它们的信号肽长度分布在15–37 aa之间,平均为24 aa。信号肽中出现频率最高的氨基酸依次为丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸,信号肽切割类型多属于A-X-A型,即SPI切割类型。共66个蛋白质有功能描述,其中包括26个酶类。这些酶主要包括各种糖苷水解酶、酯酶、蛋白酶、碳氧裂解酶等。【结论】通过上述生物信息学分析方法有效实现了银杏叶内生菌KM-1-2分泌蛋白的预测,这些分泌蛋白功能涉及较多的酶类以及其他未知功能,为进一步研究内生菌和植物的互作提供了基础。     

全基因组预测糙皮侧耳经典胞外分泌蛋白

糙皮侧耳(平菇)作为目前木质纤维素降解模式真菌,其产生的胞外分泌蛋白在植物纤维素、半纤维素及木质素降解过程中发挥着重要作用。为了给蛋白质组学鉴定糙皮侧耳胞外分泌蛋白实验提供参考,利用常见的生物信息学工具SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP对糙皮侧耳全基因组中的12 186条蛋白质序列进行经典分泌蛋白预测,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度和切割位点以及其理化性质等进行分析。结果表明,糙皮侧耳全基因组中含有359个经典分泌蛋白,其氨基酸长度主要集中于101~600之间;信号肽长度集中在18~21之间;信号肽切割位点属于A-X-A类型,除此之外还含有5条具有RR-motif的信号肽。对这些分泌蛋白进行功能注释,结果表明225个蛋白质为未知功能蛋白质;114个为已知功能蛋白质,主要功能注释集中于木质纤维素降解酶类,包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解相关酶等。以上结果表明通过上述生物信息学分析实现了对糙皮侧耳全基因组经典分泌蛋白的有效预测。     

基因组水平预测稻瘟菌分泌蛋白组及富集分析

稻瘟菌分泌蛋白在稻瘟菌入侵植物过程中发挥着重要的作用。这些分泌蛋白中有很多是效应蛋白,这些效应蛋白可以干扰寄主的抗性、抑制寄主免疫反应。因此,对稻瘟菌分泌蛋白组的预测及功能分析就显得十分必要,也是目前植物和微生物分子互作研究领域的热点。使用SignalP、TMHMM及SecretomeP等软件,完成稻瘟菌分泌蛋白组的预测。同时,对含信号肽的经典分泌蛋白进行了GO功能富集、KEGG通路分析、结构域统计以及可降解植物成分的经典分泌蛋白预测等分析。结果显示,稻瘟菌含有约789个分泌蛋白,其长度多集中在100-500 aa;GO功能分析发现,这些分泌蛋白多富集在分泌途径及宿主互作中;KEGG分析显示,分泌蛋白在糖代谢途径中发挥着重要作用;大规模筛选预测到156个分泌蛋白具有降解植物细胞壁等成分的功能;同时还发现稻瘟菌中有可能存在大量不含信号肽的非经典分泌蛋白。通过设计的生物信息学流程,实现了稻瘟菌分泌蛋白组的预测;预测出经典分泌蛋白具有可降解植物细胞壁等成分以及参与糖代谢途径的功能;稻瘟菌中存在大量的无信号肽的非经典分泌蛋白。     

希金斯炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析

目的:由希金斯炭疽菌侵染菜心、萝卜等十字花科蔬菜引起的炭疽病,不仅降低了蔬菜的产量,还影响着蔬菜的品质。RGS作为植物病原菌G蛋白信号转导过程中的重要调节因子,在众多生理生化过程中发挥着重要作用。对希金斯炭疽菌中典型RGS进行明确以及生物信息学分析,为深入开展该菌RGS功能研究打下坚实的理论基础。方法:基于酿酒酵母中4个典型RGS序列,利用Blastp以及关键词对希金斯炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析,获得典型的RGS,并对上述RGS进行二级结构、疏水性、信号肽以及亚细胞定位等生物信息学分析。结果:希金斯炭疽菌中的RGS在蛋白质二级结构中均含有较高比例的α螺旋结构,均不含有典型的信号肽序列,均为亲水性蛋白;其中3个定位在细胞核中,其他2个则分别定位于高尔基体、线粒体上。结论:希金斯炭疽菌中有5个典型的RGS,在二级结构特征、亲水性方面一致,但其亚细胞定位位置不同。     

禾谷炭疽菌磷酸二酯酶生物信息学分析

[目的]磷酸二酯酶(Pde)作为G蛋白信号传导途径上的效应酶,发挥着重要作用。该酶已在粟酒裂殖酵母菌、稻瘟病菌等中有相关报道。通过对禾谷炭疽菌中Pde生物信息学分析,以期为深入开展该蛋白定位、功能研究等方面研究,以及实现以控制病原菌G蛋白信号途径功能新的药物靶标的开发提供有力的理论支撑。[方法]基于酿酒酵母中已经报道的典型Pde序列,利用Blastp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,并通过SMART保守结构域分析、理化性质、疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对禾谷炭疽菌中的典型Pde与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析。[结果]明确禾谷炭疽菌中存在2个Pde,上述Pde均含有最低比例的色氨酸,均属于亲水性蛋白,均不含有信号肽以及均定位于细胞质等特征。[结论]通过对比,发现禾谷炭疽菌、酿酒酵母中的Pde具有诸多相同性质,提示不同真菌之间存在的保守性。     

全基因组预测多粘类芽孢杆菌SC2的分泌蛋白

为了解多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)分泌蛋白的典型特征,本研究通过SignalP、ProtCompB、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP、MEME和BLAST等多种分析程序对多粘类芽孢杆菌SC2菌株的全基因组共5 439条蛋白质序列进行生物信息的综合分析。结果表明,共获得146个具有典型信号肽的SPⅠ(Signal peptidase Ⅰ)分泌蛋白。信号肽序列中出现频率最高的氨基酸依次是亮氨酸、丙氨酸和丝氨酸。对信号肽的切割位点分析发现与枯草芽孢杆菌等一致,均为A-X-A型。通过MEME对信号肽序列进行分析发现存在一种保守基序。最后用BLAST分析发现,在146个分泌蛋白中,89个具有功能描述的分泌蛋白,主要是细胞生长代谢及生物降解酶类,其余57个皆为功能尚未明确的假定蛋白。本研究获得了多粘类芽孢杆菌SC2菌株分泌蛋白的信息,为进一步研究多粘类芽孢杆菌的蛋白功能奠定了基础。     

希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶相关蛋白生物信息学分析

[目的]希金斯炭疽菌可引起菜心、萝卜等十字花科植物的炭疽病,给经济产生巨大损失。目前,炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂所产生的抗性问题引起了学者广泛关注,有待于开发新的作用靶标的化学药剂。腺苷酸环化酶(AC)在G蛋白信号传导途径上发挥着重要作用。[方法]基于酿酒酵母中Srv2序列,通过Blastp比对及关键词搜索,并利用SMART进行保守结构域分析,同时,通过对该菌中AC相关蛋白序列进行理化性质、信号肽、跨膜结构域等分析。[结果]明确该菌含有2个与Srv2同源的AC相关蛋白Cg Cap1、Cg Cap2,就理化性质、二级结构等特征方面而言,Cg Cap1、Cg Cap2与Srv2有着较大的差异。此外,通过对Srv2与Cg Cap1、Cg Cap2及其同源序列进行比对分析,发现Cg Cap1、Cg Cap2序列分别与其同源序列及Srv2的C端、N端具有较大的相似性,推测上述序列分别为希金斯炭疽菌AC的C端和N端。[结论]该研究为深入开展该菌AC的研究打下坚实的理论基础。     

里氏木霉(Trichoderma reesei)分泌组的预测及分析

[目的]里氏木霉是一种重要的产纤维素酶工业用菌种,研究其分泌组特性具有现实意义.[方法]应用生物信息学方法对里氏木霉基因组中9997个开放阅读框(ORF)所编码的氨基酸序列进行了分析,获得了294条可能的分泌蛋白序列,并且按功能对其进行了分类,同时用搜索模体的方法在未知功能的序列中找到具有关键模体的序列,初步确定其潜在的功能.对获得的分泌蛋白的信号肽序列进行了分析.[结果]里氏木霉分泌组中有188种水解酶,包括114种糖苷水解酶、42种蛋白水解酶和11种脂类水解酶等;在糖苷水解酶中包括已报道的22种纤维素酶和15种几丁质酶等,以及30条具有潜在纤维素酶功能的蛋白序列.信号肽序列分析结果表明其同源性较低,而在信号肽酶切位点附近则相对保守.[结论]通过该预测和分析开拓了里氏木霉的研究空间,为今后的研究奠定了理论基础.     

禾谷镰刀菌基因组中含寄主靶向模体分泌蛋白功能的初步分析

基于生物信息学的方法,以SignalP v3.0、TargetP v1.01、Big-PI Predictor和TMHMM v2.0四个分析软件对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)全基因组的11 640个蛋白编码基因的N-端氨基酸序列进行信号肽分析,预测出606个潜在的分泌蛋白编码基因.通过对这些潜在的分泌蛋白进行MEME软件分析,发现其中有157个分泌蛋白的剪切点下游120氨基酸残基范围内具有一个保守的RXLX模体,其中有79个分泌蛋白具有可预测的功能性描述,包括FG00023.1具有与草酸盐氧化酶1有关的功能,FG01588.1具有与1,4-α-葡糖苷酶葡聚糖有关的功能,这些基因可作为禾谷镰刀菌致病相关的候选基因.其中FG04097.1编码的具有与丝氨酸型蛋白酶有关的功能在致病疫霉和疟原虫真核寄生物中具有相似保守的寄主靶标模体的效应蛋白中也观察到,但FG09127.1,FG05287.1编码的蛋白尚未被证明参与致病过程的研究报道.深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制.利用禾谷镰刀菌基因组学研究成果,结合计算机技术和生物信息学的方法,分析其分泌蛋白组学,将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能.对于这些蛋白功能的比较研究,将有利于对禾谷镰刀菌致病性的分子机制的探索,并为设计新的防治措施提供理论依据.     

粗糙脉孢菌基因组分泌蛋白的初步分析

文章报道利用信号肽预测软件SignalP v3.0和PSORT,跨膜螺旋结构预测软件TMHMMv2.0和THUMBUP,GPI-锚定位点预测软件big-PI Predictor和亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1.01对粗糙脉孢菌全基因组数据库中已公布的10 082个氨基酸序列进行预测分析。结果表明在粗糙脉孢菌中有437个蛋白为分泌蛋白,编码这些蛋白最小的可读框（open reading frame,ORF）为252 bp,最大为6 604 bp,平均1 433 bp,分泌蛋白信号肽长度介于15~59个氨基酸之间。在437个分泌蛋白中,205个具有功能描述,主要包括各种酶类、细胞能量生成、运转以及自身修复、防卫等多种功能。这些蛋白所参与的生化过程可能发生在膜外的周质空间或是菌体外的场所,为该物种营养的摄取,以及对环境做出响应服务。      

大肠埃希氏杆菌UTI89分泌蛋白组的预测分析

目的：从大肠埃希氏杆菌UTI89基因组中筛选出全部潜在的分泌蛋白并进行初步研究。方法：使用SignalP3.0、TatP1.0、 SecretomeP2.0等蛋白分析软件对5211个ORF进行预测;对筛选出的信号肽及分泌蛋白的基本特征进行统计学分析;使用Blast 2 Sequences进行同源性分析。结果：共筛选出432个sec途径分泌蛋白,19个Tat途径分泌蛋白,386个非经典分泌蛋白;信号肽、分泌蛋白平均长度分别为25.5aa、282.8aa;信号肽中出现频率最高的3种氨基酸依次为L、A、S;仅有两个信号肽的氨基酸序列完全相同,相应的分泌蛋白高度同源。结论：大肠埃希氏杆菌UTI89基因组中有837个ORF可能编码分泌蛋白;分泌蛋白集中在500aa以下;组成信号肽的氨基酸相对保守,多数为疏水氨基酸;信号肽变异性较大,含相同信号肽的蛋白可能由同源基因编码。     

苏云金芽胞杆菌分泌蛋白的鉴定及分析

研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在生长发育过程中分泌蛋白的类型和含量,尤其是胞外蛋白酶,对于充分了解该菌的杀虫机理、扩大该菌的应用具有重要意义。通过制备Bt_HD73过渡期(transition phase)的分泌蛋白质样品,进行质谱检测并分析其分泌蛋白的种类、含量、功能和信号肽等。结果表明,Bt_HD73在过渡期初期有54种胞外蛋白质,其中酶类最多,占所有分泌蛋白的66.30%,且主要为蛋白水解酶;毒力蛋白次之,占所有分泌蛋白的14.53%。在54种分泌蛋白中,发现27种含有经典Sec型信号肽(Secretory signal peptide,Sec-type SP),信号肽的长度在24-40个氨基酸之间。因此,Bt_HD73产生分泌蛋白的能力较强,在过渡期可分泌大量酶类,尤其是蛋白水解酶。同时还建立了该菌株的信号肽库,包括27种具有引导外源蛋白分泌潜力的信号肽。     

禾谷炭疽菌磷脂酰肌醇转移蛋白生物信息学分析

目的:禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等农作物引起的炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。植物病原菌在对植物侵染、定殖、扩展等致病过程中,细胞信号转导起着重要的作用。磷脂酰肌醇转移蛋白(PITP)参与众多生理生化过程,并在细胞信号转导过程中发挥重要作用。本研究为深入开展禾谷炭疽菌PITP的功能研究打下坚实的理论基础,同时,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。方法:基于酿酒酵母中已经报道的5个典型PITP序列,对炭疽菌属蛋白质数据库进行Blastp比对以及关键词搜索,并通过SMART保守结构域分析。结果:明确禾谷炭疽菌存在3个典型的PITP,同时,明确上述蛋白疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等情况。结论:与其他物种中9个同源序列进行遗传关系比较分析,该菌与希金斯炭疽菌亲缘关系较近。     

肠激酶轻链在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]构建牛肠激酶轻链(EK_L)毕赤酵母组成型高效分泌表达系统。[方法]人工合成MF-α信号肽与EK_L融合基因,克隆于pGAPzα-A和野生毕赤酵母X-33。镍柱纯化EK_L,内切糖苷酶H(Endo H)消化法鉴定糖基化,软件分析糖基化位点,以含EK_L位点的融合蛋白作底物验证酶学活性。[结果]获得了8株EK_L的高抗性毕赤酵母转化子,其中7株可组成型分泌表达目的蛋白,在摇瓶中表达水平约为20 mg/L。分析表明,EK_L表达产物为分子量约43 kDa的N型糖基化蛋白,可有效切割含识别位点的融合蛋白。[结论]成功构建了EK_L毕赤酵母组成型高效分泌表达系统。     

稻瘟病菌含信号肽小蛋白的计算机分析

结合计算机技术和生物信息学的方法,采用组合的信号肽分析软件SignalPv3.0、TargetPv1.1、Big-PIpredictor、TMHMMv2.0和SecretomeP对已公布的1486个稻瘟菌(magnaporthegrisea)小蛋白基因的N-端氨基酸序列进行信号肽分析,同时系统分析了信号肽的类型及结构。分析结果表明,在1486个稻瘟病菌小蛋白中,119个具有N-端信号肽的典型分泌蛋白。其中116个具有分泌型信号肽,1个具RR-motif型信号肽,2个具信号肽酶II型信号肽。在稻瘟病菌基因组中,分泌型小蛋白的序列是高度趋异的,仅出现少数氨基酸组成完全一致的信号肽,为进一步确认具有相同信号肽的分泌蛋白是否具有同源性,分别用BLAST2SEQUENCES对具有相同信号肽的分泌蛋白进行了序列对比。结果表明,具有相同信号肽的分泌蛋白同源性非常高。同时还采用Sublocv1.0对1486个小蛋白的亚细胞位置进行了预测,结果显示小蛋白的可能功能场所包括细胞质、细胞外、线立体和细胞核,功能场所位于细胞核的小蛋白是最多的。     

马铃薯晚疫病菌全基因组分泌蛋白的初步分析

利用马铃薯晚疫病菌全基因组测序结果,结合计算机技术和生物信息学的方法,对马铃薯晚疫病菌的蛋白进行分析,为明确该病原菌与寄主互作的分子机制奠定基础。文章应用信号肽预测软件SignalP v3.0和PSORT,跨膜螺旋结构预测软件TMHMM-2.0和THUMBUP,GPI锚定位点预测软件big-PI Predictor,亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1.01,对已经公布的马铃薯晚疫病菌全基因组22 658个蛋白质氨基酸序列进行分析。结果发现,晚疫病菌全基因组编码蛋白中有671个为潜在的分泌型蛋白,占编码蛋白总数的3.0%。其中有45个分泌蛋白有功能方面的描述,其功能涉及细胞代谢、信号转导等方面;此外,还有一些与激发子类似的分泌蛋白,它们可能与晚疫病菌的毒性有关。     

基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。     

禾谷炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析

【目的】明确禾谷炭疽菌中存在的典型RGS,及其信号肽、跨膜区、二级结构特征,明确该菌RGS与其他病菌之间的关系,最终为深入开展RGS定位、功能研究打下坚实的理论基础,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。【方法】基于酿酒酵母中已经报道的4个典型RGS序列,利用BLASTp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析。同时,通过对禾谷炭疽菌中典型RGS氨基酸序列进行细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对禾谷炭疽菌中的典型RGS与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析。【结果】明确禾谷炭疽菌存在6个典型的RGS,上述RGS在蛋白质二级结构中均含有较高比例的α螺旋结构,而在信号肽方面,除CgRGS6含有明显的信号肽序列外,其他RGS则没有;6个RGS中3个定位在细胞核中,其他则定位在质膜、内质网、线粒体上。【结论】禾谷炭疽菌中的RGS与C.higginsianum、C.gloeosporioides Cg-14/Nara gc5、C.orbiculare等炭疽菌属中的病菌具有较高的同源序列,以及较近的亲缘关系。