结直肠癌血清肿瘤标记物液相芯片制备条件的优化及在CEA抗原检测中的初步应用

液相芯片技术由于其高通量,灵敏度高,信噪比高,液相条件下反应,操作简便,耗时短等优点,已被美国FDA批准成为临床的检测手段。本文主要介绍了结直肠癌血清肿瘤标记物液相芯片制备条件的优化及其在CEA抗原检测中的初步应用。本研究首先将CEA抗原的捕获抗体与微球载体进行偶联,制备液相芯片,然后对影响反应的微球与抗原的反应时间,生物素化检测抗体的浓度及avidin-PE荧光染料的反应浓度等因素进行正交设计,确定出最优的反应条件;用该液相芯片反应体系检测55例临床样本,与ELISA试剂盒检测结果相比：在同样的样本浓度范围内,两者的检测结果基本一致,但液相芯片检测的浓度范围更大而且液相芯片可将多种肿瘤标记物在一个反应进行检测,节省检测的时间和人力。     

蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的条件优化

目的:建立一种以琼脂糖修饰的玻片为载体的蛋白质微阵列制备的优化方法,比较琼脂糖修饰玻片和醛基修饰玻片及氨基修饰玻片对蛋白质固定效率的优劣。方法:将羊IgG固定在载体表面,经过洗涤、封闭,再加入Cy3标记的兔抗羊IgG,孵育,洗涤后用共聚焦激光扫描仪获取图像,检测各点的荧光强度,根据荧光强度确定最佳琼脂糖浓度,最佳NaIO4浓度,最佳固定时间以及封闭时间等实验条件。结果:琼脂糖浓度为1.2％、NaIO4浓度为20mmol／L、固定时间为1h、孵育时间为45min时,蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高。在固定的抗体浓度相同的情况下,琼脂糖修饰玻片荧光强度是醛基修饰玻片的2.6倍,是氨基修饰玻片的9倍。结论:确立了蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的优化条件,用该优化条件制备的琼脂糖玻片更适合用于蛋白质微阵列载体。     

流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒

[目的]建立流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒(PVA)的新方法.[方法]以荧光微球为反应载体,通过在微球表面进行双抗夹心免疫反应形成微球-捕获抗体-PVA-标记FITC检测抗体的复合物,利用流式细胞仪荧光检测系统收集荧光信号.[结果]通过实验优化检测条件,最佳捕获抗体工作浓度为4μg/mL、最佳检测抗体工作浓度为1:25倍稀释、最佳反应时间为2h;与马铃薯Y病毒、莴苣花叶病毒、番茄环斑病毒等均未出现交叉反应;阳性样品经64倍稀释后依然可检出,检测灵敏度是传统微孔板ELISA的4倍.[结论]流式微球一步法能灵敏、快速、简便的检测马铃薯A病毒.     

ova和HPV E_6及其蛋白滴鼻免疫增强小鼠抗体水平

[目的]探讨ova和HPV E_6及其蛋白通过滴鼻共免疫的方式提高抗体水平的有效性。[方法]选择ova和OVA蛋白,HPV E_6和HPV E_6蛋白滴鼻共免疫ICR小鼠,检测免疫后小鼠血清中的Ig G、Ig G1、Ig G2a和s Ig A,生殖道黏液中s Ig A的表达水平。[结果]ova及其蛋白共免疫组血清中的抗体Ig G及其亚类、血清和生殖道洗液中的s Ig A与对照组相比差异极显著(P0.01),初免后第28 d,血清中的Ig G抗体滴度达到28万。HPV E_6与其蛋白共免疫组血清中的抗体Ig G及其亚类、生殖道洗液中的s Ig A与对照组相比差异极显著(P0.01),初免后第35 d,血清中的Ig G抗体滴度达到25万。[结论]用ova和HPV E_6及其蛋白通过滴鼻共免疫,产生高水平抗体,共免疫组的抗体水平比基因疫苗组增强了近百倍,比蛋白免疫组增强了2.5倍,表明这种免疫方式能够有效激发黏膜免疫反应和系统免疫反应。     

稳定表达可视化hFcRn的MDCK细胞株构建

[目的]建立稳定表达融合EGFP的人新生儿Fc受体(h FcRn)的MDCK细胞株。[方法]构建重组慢病毒质粒p EGFP-h FcRn,采用四质粒包装系统共转染HEK 293T细胞生产重组慢病毒,感染MDCK细胞后对EGFP阳性细胞进行流式单细胞分选;通过Western Blot及EGFP-β2m荧光共定位验证h FcRn的完整性,并用流式细胞仪检测h FcRn与人Ig G的结合活性。[结果]测序结果表明成功构建p EGFP-FcRn慢病毒表达载体;感染后EGFP阳性MDCK细胞比例约为26.5%,流式单细胞分选后得到纯阳性细胞;荧光共定位及Western Blot均检测到h FcRn的完整表达;流式分析表明细胞株上的h FcRn与Ig G存在p H依赖性结合。[结论]成功获得稳定表达具有生物活性的可视化h FcRn的MDCK细胞株。     

獐子菌多糖SIK-1的结构鉴定及其生物活性研究

[目的]探索獐子菌多糖(Sarcodon imbricatus (L. ex Fr.) Karst polysaccharide,SIK-1)的结构及对其调控小鼠免疫细胞和小鼠结肠癌细胞(CT26. WT)生长的影响。[方法]采用核磁共振谱(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy,NMR)检测SIK-1的结构,CCK-8法检测细胞增殖率、抑制率和吞噬率,Elisa试剂盒检测小鼠免疫B细胞分泌抗体Ig A、Ig G、Ig M的分泌率。[结果]SIK-1的1H NMR谱数据显示SIK-1含有α型吡喃糖和β型吡喃糖;13C NMR谱数据显示獐子菌多糖中含有6个糖残基,由3个α型糖残基和3个β型糖残基构成的重复结构单元。SIK-1质量浓度为5μg/m L和10μg/m L时能极显著地促进T细胞、B细胞和RAW264. 7细胞的增殖;且能抑制CT26. WT的生长,且呈一定的剂量关系; SIK-1质量浓度在15μg/m L时能显著促进B细胞分泌免疫因子Ig A、Ig G、Ig M; SIK-1质量浓度为5μg/m L时能显著提高巨噬细胞的吞噬能力。[结论]...     

胶体金渗滤方法检测乙肝患者血清中乙肝核心抗体的研究

目的:建立胶体金免疫渗滤法检测乙肝患者血清中乙肝核心抗体(anti-HBc Ig M)抗体的方法,评价其灵敏度、特异性和重复性。方法:预先在硝酸纤维素膜上包被乙肝核心抗原HBc Ag,将血清或者血浆加在硝酸纤维素膜上,血清或者血浆中的anti-HBc Ig M与HBc Ag结合。洗涤去掉非特异结合,加入胶体金标记的抗人-Ig M,洗涤去掉没有结合的抗人Ig M抗体。硝酸纤维素膜上的抗原-Ig M-抗人Ig M形成的"三明治"复合物呈现红色圆点,证实实验有效。结果:102份乙肝患者血清,anti-HBc Ig M阳性标本99份。检出率97%。50份正常血清中,有一份检测结果弱阳性,特异性98%。结论:胶体金免疫渗滤法检测anti-HBc Ig M敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要特殊的仪器设备,在anti-HBc Ig M快速检测上有广阔的应用前景。     

用于检测葡萄球菌肠毒素的免疫芯片技术

免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵 ,是继基因芯片之后提出的一种新型的生物芯片。在检测大分子物质葡萄球菌肠毒素 (SE)时采用双抗体夹心法。检测时将SEA、SEB、SEC加入反应池中 ,反应后清洗掉未结合的SE ,再加入相应的标记抗体 ,形成固定抗体 待测物 标记抗体的夹心式结构。对影响免疫芯片检测效果的条件进行了优化 ,按优化后的条件进行SEA、SEB、SEC的检测 ,结果表明荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加 ,当浓度高于一定值时 ,荧光信号强度趋于一定值 ,本法最低可检测 0.0 1 μg ml的SEA和SEB及 0.1 μg ml的SEC。将此项技术应用于环境和食品中污染物检测领域 ,将会使卫生监督工作水平得到明显的提高。     

小鼠血清中杀O139霍乱弧菌抗体检测方法的初步建立

目的研究探索O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法。方法用微孔板培养和琼脂平板克隆计数相结合的杀弧菌抗体检测方法,对实验菌株及稀释度、补体浓度等关键参数进行筛选;对50份小鼠免疫血清进行杀弧菌抗体滴度检测,并与O139群霍乱弧菌LPS Ig G抗体滴度进行相关分析;对该方法的特异性、线性和精密性进行了验证。结果筛选出最佳菌株为20100603菌株,最佳稀释度倍数为2 000倍,补体最佳稀释倍数为16倍。O139群霍乱弧菌小鼠免疫血清检测到较高的杀弧菌抗体滴度而PBS小鼠免疫血清未检测到杀弧菌抗体滴度。小鼠免疫血清杀弧菌抗体滴度与O139群霍乱弧菌LPS Ig G抗体滴度之间存在正相关关系。验证结果显示,在抑制剂浓度达到1.0~2.0 A600时,抑制率100%;线性回归方程为y=-1.093x+5.058,其相关系数为-0.999,P0.05;方法批内CV值为15.72%,批间CV值为23.47%。结论初步建立了O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法,该方法具有较高的特异性、线性和精密度。     

一种人抗PD-L1单抗的间接ELISA方法的建立

[目的]制备一种人抗PD-L1抗体,建立其酶联免疫吸附分析(ELISA)的检测方法。[方法]将表达抗体重链和轻链的质粒转染到HEK-293细胞制备抗体,并建立ELISA方法对抗体进行检测。[结果]间接ELISA法的最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL,抗PD-L1抗体标准品的起始浓度为0.25μg/mL,最适封闭液浓度为2%BSA,最适封闭时间为2 h,二抗的最佳稀释度为1∶4 000。细胞上清中的抗PD-L1抗体样品1的滴度为125,浓度66.66 ng/mL,灵敏度为6.3 ng/mL;样品2的滴度为125,浓度为81.8 ng/mL,灵敏度为5.9 ng/mL。[结论]建立了一种人抗PD-L1单克隆抗体的间接ELISA检测方法,经对样品1和样品2的批内批间重复性试验统计分析,变异系数均10%,该ELISA法适用于该抗体的检测。     

新生溶血病患儿红细胞上致敏抗体对Rh 血型检测的影响

目的:探讨新生溶血病患儿红细胞致敏抗体对其Rh血型鉴定的影响。方法:采用抗球蛋白法、盐水法、微柱凝胶法(Rh血型测定型)、凝聚胺法和抗血清微柱凝胶法(Ig G型)五种方法对近三年来我院收集的163例新生溶血病患儿红细胞进行Rh血型检测,对五种检测结果不一致的患儿红细胞进行0.2 M 2-巯基乙醇抗体放散,比较放散后五种方法检测结果并验证其准确性。结果:29例直接抗体试验阳性患儿的五种Rh血型检测结果不一致,经0.2 M 2-巯基乙醇抗体放散后检测结果均一致。Rh血型准确性验证表明,红细胞放散测定的Rh血型完全符合临床现象。结论:患儿红细胞的致敏抗体达一定数量后,会影响抗球蛋白法、盐水法、微柱凝胶法(Rh血型测定型)、凝聚胺法和抗血清微柱凝胶法(Ig G型)对Rh血型鉴定,0.2M 2-巯基乙醇抗体放散法是一种正确鉴定新生儿Rh血型的简单可行的方法。     

蛋白质微阵列检测抗原-抗体相互作用

为了制备蛋白质微阵列和研究芯片表面抗原-抗体的相互作用,研究了如何在玻片表面固化蛋白质和用荧光染料（Cy3,Cy5）对蛋白质进行标记.结果表明,在醛基修饰的玻璃表面,通过共价偶联的方法将抗原或抗体固定到芯片表面,能使二者保持其特异性结合能力.同时,荧光标记后的抗原或抗体仍然具有特异性结合能力.蛋白质微阵列是通过机械手在玻片表面排阵制作的.芯片上的荧光信号获取采用了激光共焦荧光扫描系统.用不同浓度的抗原探针阵列,对其相应的抗体靶分子的特异性结合进行了分析和研究.此外,还通过在玻片表面固定兔IgG和固定鼠IgG,对羊抗兔和羊抗鼠抗体与其相应抗原的特异性相互作用进行了检测.     

聚丙烯酰胺凝胶固定核酸方法及其应用

固相核酸已被广泛用于DNA/cDNA微阵列、固相PCR及其它核酸与生物分子检测的传感技术中.和硬质玻璃载片相比,三维聚丙烯酰胺凝胶作为固定核酸的载体具有结合核酸容量高、利于反应的类似液相环境和较少的空间效应等优点.综述了丙烯酰胺凝胶作为固定核酸载体的发展历史.着重介绍了丙烯酰胺修饰核酸直接聚合固定的方法以及在DNA芯片、焦测序、固相PCR(克隆)、及全基因组测序等核酸分析中的应用.     

CD45新型免疫荧光标记与检测方法研究

使用经生物修饰后的荧光纳米颗粒,探索了白细胞共同抗原CD45的新型荧光标记与检测方法。将联吡啶钌配合物[三(2,2-联吡啶)氯化钌,六水]为核,二氧化硅为外壳的荧光纳米颗粒用鼠抗人CD45Pur进行生物修饰后,对人体白细胞进行荧光标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记样品的细胞数目和荧光强度,结果表明,该新型荧光标记方法的灵敏度高,光学稳定性好,可准确有效地识别人体白细胞。     

MMP3慢病毒表达载体构建及其修饰的胚胎干细胞的作用

[目的]构建基质金属蛋白酶3(Matrix metalloproteinase3,MMP3)基因过表达慢病毒载体,修饰胚胎干细胞(ES)检测其对成纤维细胞的作用。[方法]克隆MMP3基因,构建EGFP标记的MMP3慢病毒表达载体,用GP2-293T细胞包装慢病毒,修饰ES细胞,与成纤维细胞3T3共培养。镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western Blot检测MMP3和TGF-β蛋白表达。[结果]成功钓取MMP3基因,并构建慢病毒表达载体LV-MMP3-EGFP;在转染的GP2-293T细胞中表达绿色荧光蛋白;修饰后的ES细胞表达绿色荧光蛋白,72 h蛋白表达量最高,转染效率达到80%以上;被修饰细胞中MMP3蛋白表达高于对照组,其表达量是对照组的1.5倍;共培养后3T3细胞中TGF-β蛋白表达实验组与对照组无显著变化。[结论]LV-MMP3-EGFP修饰的ES细胞能够大量表达MMP3蛋白,作用于细胞外基质,但是对成纤维细胞中TGF-β表达没有显著影响(P0.05)。     

蛋白芯片生产用醛基化玻片制备的条件优化及初步检定

建立一种以玻片为基质的蛋白芯片制备的优化及检定方法。将经过清洗处理的玻片,用不同浓度的氨基硅烷试剂和戊二醛试剂,在不同的时间内,进行氨基化和醛基化处理,通过蛋白结合强度与处理时间及溶剂浓度的动力学相关性分析,确定最佳的优化条件,将不同浓度梯度的人IgG抗体结合于该玻片表面,经过洗涤、封闭,再加入Cy3荧光标记的二抗,孵育,洗涤后检测各点的荧光强度,确定其线性范围及其检测灵敏度。氨基硅烷试剂浓度为5%,作用时间为30min;戊二醛试剂浓度为2.5%,作用时间为60min时,蛋白结合强度达到饱和。蛋白芯片在2～2×4-7mg/ml浓度范围内有良好的线性,能够检测出人IgG的最低浓度为2×4-8mg/ml。     

基于万古霉素建立荧光酶联免疫吸附法检测金黄色葡萄球菌

以猪IgG作为捕获抗体固定金黄色葡萄球菌,修饰有万古霉素的量子点荧光微球作为"检测抗体",建立荧光酶联免疫吸附法检测金黄色葡萄球菌。文中制备了平均粒径为100 nm的量子点荧光微球并与万古霉素偶联;摸索了反应最佳盐离子浓度为0.01 mol/L,反应最佳pH为6.0。在该实验条件下,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为104 CFU/m L,与其他致病菌无交叉反应。以上结果表明,该方法可用于快速检测金黄色葡萄球菌,为金黄色葡萄球菌的临床监控和食品检测提供参考。     

头孢噻肟的结构修饰及其体外抗菌活性变化

[目的]头孢噻肟是第三代头孢菌素类抗生素,抗菌谱广,对革兰氏阴性菌G-作用较好,但对革兰氏阳性菌G+,如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.a)等活性较弱。头孢噻肟的母核是7-氨基头孢烷酸(7-ACA),对其活性基团7位氨基进行修饰,考查抗G+的活性。[方法]以戊二醛作为偶联剂在头孢噻肟的7位氨基上偶联壳聚糖,并利用红外光谱进行表征,以流式细胞术检测到的荧光强度或碘化丙锭(PI)染色细胞百分率(PI%,被PI染色的细胞比例)为度量指标。[结果]S.a与修饰的头孢噻肟作用后荧光强度明显增加,修饰前后头孢噻肟的样品PI%分别为28.9%、68.8%,可见头孢噻肟修饰后对S.a的活性大大增强。[结论]修饰后的头孢噻肟与S.a作用后的样品荧光强度增加了近40%,由此推测头孢噻肟的7位氨基是一种很有前途的提高杀菌效果的活性基团。     

负载白藜芦醇自组装多肽水凝胶的抗菌性能研究

[目的]制备一种负载白藜芦醇的自组装多肽水凝胶并探讨其抗菌性能。[方法]通过自组装制备多肽(FmocFFGGRGD)水凝胶和载有白藜芦醇的多肽水凝胶(Pep/RES);通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察水凝胶的形貌和内部结构;通过流变仪检测水凝胶的流变性质;通过高效液相色谱检测Pep/RES的释放速率;通过细胞毒性试验研究该水凝胶的生物相容性;通过抑菌圈实验和活死细菌染色研究Pep/RES对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。[结果]多肽溶液可在30 min内自组装形成稳定的水凝胶,水凝胶内部的三维结构密度随多肽浓度的增加而增加,2.0wt%浓度的多肽水凝胶稳定效果最好。白藜芦醇从Pep/RES水凝胶中缓慢释放7 d释放量达到50%,Pep/RES浸泡液对NIH/3T3细胞表现出良好的生物相容性。Pep/RES水凝胶中负载的白藜芦醇浓度为512μg/m L时,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径即可达到5.41±0.18 mm,但即使白藜芦醇浓度达到1 024μg/m L,对大肠杆菌的抑菌圈直径仅为4.27±0.22 nm。[结论]Pep/RES结构稳定,安全无毒,能缓释白藜芦醇,并对金黄...     

秀丽线虫天然粗提物对哮喘治疗效果研究

探讨秀丽隐杆线虫天然粗提物的提取及对哮喘动物治疗效果。将线虫经离心、洗涤、超声乳化、去除内毒素等方法获得线虫粗提物(CEC),以鸡卵清蛋白(OVA)致敏BALB/c雌性小鼠建立哮喘动物模型,用CEC与OVA混合物(CE)对哮喘动物治疗,以缓冲液(PBS)和OVA为对照,用ELISA法检测血清Ig E、Ig G1、Ig G2a抗体,分类计数支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞,切取肺组织观察病理。研究显示,CE组与OVA组比较,血清Ig E、Ig G1、Ig G2a差异有统计学意义(P0.05),BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等差异有统计学意义(P0.05)。线虫天然粗提物对哮喘动物有一定治疗效果。