转录组测序及其在药用植物上的应用

RNA-Seq是一种新崛起的转录组学研究方法,新一代测序技术(NGS)能够更快速、更准确地为人们提供更多的生物体转录信息,已被广泛应用于医学研究、生物学研究、药物研发和临床研究等领域。药用植物转录组是现今研究药用植物基因组最活跃的领域之一,我们可从整体水平了解细胞中基因表达情况及其调控规律。对转录组的研究将有助于解决遗传育种和基因进化等诸多方面的问题。本综述简要介绍了转录组测序的原理,并从功能基因挖掘、SSR分子标记开发和代谢途径探索等3个方面综述了国内外近5年的转录组测序在药用植物上的应用进展,为药用植物的研究提供了更多基础数据。     

基于新一代测序技术的昆虫转录组学研究进展

新一代测序技术具有快速、 高通量和低成本的特点, 为“组学”研究带来了新方法、 新方案, 正在深刻地改变着当前生物学的研究模式。近年来, 新一代测序技术极大促进了昆虫特别是无参考基因组信息昆虫的转录组学研究。自2008年至今, 采用新一代测序技术已对7个目的68种昆虫进行了转录组测序, 其中由我国学者完成了6个目的22种昆虫的转录组测序。目前, 昆虫转录组学研究主要集中在基因挖掘、 分子标记开发、 基因表达分析等方面, 为全面揭示昆虫生命活动中相关基因功能、 系统发生与进化以及昆虫与其他生物相互作用等奠定了基础。本文总结了当前昆虫转录组学研究的已有成果, 分析了其今后的发展趋势, 讨论了采用新一代测序技术开展昆虫转录组学研究中存在的诸如研究对象相对局限、 测序准确性不够高等不足, 并指出开展昆虫转录组学研究时需充分思考所要回答的科学问题, 选择合适的研究策略, 评估性价比, 以及开发转录组信息高效利用的方法等。作者建议未来的研究方向侧重于： （1）大规模开展基于新一代测序技术的昆虫转录组学研究, 特别是对其他目以及独特生态环境中的代表性昆虫应予以重点关注; （2）开发昆虫转录组数据存储及分析的软硬件; （3）合理利用新一代测序技术研究昆虫转录组并充分挖掘已测昆虫转录组中的遗传信息。     

转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用

转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。RNA-Seq作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测序,通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量,发现新的转录本;如果有基因组参考序列,可以把转录本映射回基因组,确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息,已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要介绍了RNA-Seq原理、技术特点及其应用,并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论,为今后该技术的研究与应用提供参考。     

泽兰实蝇雄性附腺高通量转录组测序数据组装和分析

泽兰实蝇Procecidochares utilis Stone是恶性杂草紫茎泽兰Eupatorium adenophorum Spreng重要的专食性天敌。为进一步开发泽兰实蝇的基因资源,深入了解其遗传信息,本研究采用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对泽兰实蝇的雄性附腺组织进行了转录组测序,构建了转录组数据库,获得62 684 346条Clean Reads数据;拼接组装后获得89 195条Unigene数据,平均长度为898 bp;与NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO、KOG七大数据库进行Blast信息比对(E-value为10~(-5)),共获得52 743个注释基因;与NR数据库比对发现,泽兰实蝇雄性附腺转录组基因序列与瓜实蝇Bactrocera cucurbitae具有较高的同源性,为29.1%;将泽兰实蝇转录组的Unigene的功能通过与KOG数据库进行注释比对划分为25类;GO数据库注释可分为3类,即细胞组分、生物过程和分子功能,共包括65个分支;KEGG分析发现,泽兰实蝇转录组数据中按照代谢通路可分为92类,利用Blast蛋白库比对和Estscan软件进行CDS预测,获得长度大于300 nt的CDS共48 509个;通过SSR分析,共获得69 352个SSR标记,数量最高的SSR类型为单碱基重复,为47 139条,出现频率为67.97%,最少的是五碱基重复SSR,只有27条,出现频率仅为0.039%。本研究中获得的转录组信息可为今后进行泽兰实蝇分子标记的开发和关键基因的克隆及功能分析等研究提供基础数据。     

转录组与RNA-Seq技术

转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合.通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达、研究结构变异及发现新基因等.转录组分析的研究方法、研究平台发生着日新月异的变化,同时生物信息学分析的内容也在逐渐完善.RNA-Seq作为一种新的转录组研究手段,利用新一代测序技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息.主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台,并着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析等及在相关领域的应用等内容,为相关的研究和应用提供参考.     

小鼠不同脑区星形胶质细胞小分子诱导转分化和基因表达差异的研究

该文旨在比较小分子化合物诱导小鼠不同脑区星形胶质细胞向神经元转分化的特性,并利用转录组测序技术分析小鼠不同脑区星形胶质细胞的基因表达差异。以新生小鼠皮层和海马的星形胶质细胞作为起始细胞,通过小分子化合物VCR诱导其向神经元转分化,利用免疫荧光染色检测转分化过程中细胞形态的变化以及神经元的比例,通过转录组测序比较两种星形胶质细胞的基因表达差异,并对差异基因进行荧光定量PCR验证及GO富集分析。结果表明,皮层星形胶质细胞经VCR诱导转分化为神经元的能力要显著优于海马星形胶质细胞;转录组测序发现,两种星形胶质细胞有12 658个基因存在差异表达,GO分析结果表明,在皮层星形胶质细胞中高表达的基因更多地参与细胞分裂的过程,推测差异显著基因GAD2、EYA2、GSX2、INSM1以及GNG3是与转分化相关的基因。该研究对星形胶质细胞向神经元转分化的机制研究具有借鉴意义。     

通过系统分析揭示组蛋白修饰模式与转录因子结合之间的关联

转录因子对顺势调控元件的选择性结合,在哺乳动物细胞类型特异的基因表达中扮演重要的角色.这个过程受到染色质表观遗传状态的潜在调控.近期,染色质免疫共沉淀结合测序的研究提供了大量泛基因组水平的数据,阐述转录因子结合以及组蛋白修饰的位点,这为系统地研究转录因子和表观遗传标记之间的空间及调控关系提供了基础.该研究对公共数据库中的染色质免疫共沉淀结合测序数据进行整合分析,涉及5个细胞系中的85种转录因子、9种组蛋白修饰,目的是研究转录因子结合位点与组蛋白修饰模式以及基因表达在泛基因组水平上的关联.作者发现,不同转录因子与组蛋白修饰的共定位模式高度一致,并且组蛋白修饰在距离转录因子结合位点约500碱基对的位置富集.作者还发现,转录因子结合位点的占有率与活性组蛋白修饰的水平和双峰模式正相关,并且启动子区域组蛋白修饰的双峰和共定位模式和基因的高转录水平相一致.组蛋白修饰模式、转录因子结合位点的占有率与基因转录之间的关联暗示了细胞可能利用的基因表达调控机制.     

梨小食心虫幼虫中肠转录组及SSR分子标记分析

【目的】梨小食心虫Grapholitha molesta是一种重要的世界性果树害虫。昆虫中肠在食物消化、免疫反应、生长发育等方面发挥着重要作用。本研究旨在建立梨小食心虫幼虫中肠转录组数据库,挖掘其基因信息。【方法】利用高通量测序平台(Illumina HiSeq X Ten)对梨小食心虫幼虫中肠进行转录组测序、组装及生物信息学分析;进而利用转录组数据进行梨小食心虫幼虫中肠SSR分子标记鉴定。【结果】总计获得梨小食心虫幼虫中肠转录组96 419条unigenes,与公共数据库比对,共注释到57 300条unigenes。通过GO数据库注释,将unigenes的功能分为生物学进程、细胞组分和分子功能三大类55个功能区,其中参与细胞进程、细胞和细胞组分及结合功能的unigenes比例较大。KOG结果显示,10 090条unigenes归到25个基因家族,注释到一般功能预测的最多。KEGG数据库中,10 250条序列注释到232个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多。此外,用MISH软件,在10 600条unigenes中搜索到12 690个SSR位点,通过PCR开发出6个SSR位点。【结论】本研究成功组装梨小食心虫幼虫中肠参考转录组,为以中肠为靶标的害虫防治提供理论依据。     

单细胞转录组测序数据分析算法在干细胞研究中的应用

细胞的转录组决定其生理状态,每个细胞的转录组都是唯一的。借助单细胞转录组测序可分析单个干细胞的转录组特征,通过进一步的运算方法可以根据转录组特征对细胞进行细胞状态测定以及系谱分化特征的重建,在干细胞及组织发育研究中发挥了强大的作用,推动了其快速发展,加速了对干细胞分化及组织发育的相关过程及调控路径的认识。尤其是在干细胞领域的应用,得益于新算法的发展,单细胞转录组测序分析可用来阐述干细胞的起源、异质性,尤其是对干细胞的分化过程进行连续观察。本文主要对应用于干细胞分化相关研究的单细胞转录组测序数据新的算法及其应用进行了综述。     

植物单细胞转录组测序研究进展

单细胞转录组测序是一种在单细胞水平上研究基因表达的技术.多孔板法和液滴法是目前应用于植物研究的两类主要的单细胞转录组技术.首先概述了植物单细胞转录组测序的技术原理和数据分析流程,然后介绍了植物单细胞转录组的研究进展,重点阐述了单细胞转录组测序技术在鉴定植物细胞类型、揭示细胞演化轨迹和构建细胞间调控网络中的应用.单细胞转...     

单细胞转录组测序技术在动物上的应用研究

细胞是机体最基本的结构组成及功能单位,细胞类型和功能由其整个转录表达谱决定,通过单细胞转录组测序可以获得单个细胞转录表达谱,由此以高精度分辨率鉴定细胞类型、细胞状态以及稀有类型细胞,从而可以在单细胞水平分析细胞动态变化及细胞间的关系,深入解析驱动细胞变化及细胞异常背后的分子细胞机制。随着单细胞测序技术稳定性和测序通量的提高,以及测序成本的降低,其在发育生物学、肿瘤、免疫及疾病等领域被广泛应用,研究对象主要涉及人及模式生物,在动物上的应用研究相对较少。本文主要介绍单细胞转录组测序技术及其生物学应用并综述目前其在动物上的一些开创性研究,以期为今后更好的在动物上应用单细胞转录组测序提供方法参考。     

核糖体谱测序在病毒学研究中的应用

核糖体谱测序结合了RNA深度测序和核酸酶足迹技术,可同时检测细胞内全部基因的转录和翻译。用此方法检测被病毒感染的细胞,不但有可能发现新的病毒蛋白,完善病毒基因组注释,而且还可能发现新的基因翻译现象,为研究翻译机制指明方向。同时,该方法能够检测到被病毒感染后宿主翻译水平的动态变化,为研究病毒和宿主之间的相互作用提供线索。目前,学者已经利用核糖体谱测序法分析了6个DNA病毒和4个RNA病毒感染细胞后翻译相关的特征。本文对核糖体谱测序方法在病毒学中的相关研究进行总结和分析,希望为广大病毒学研究者提供新的方法与思路。     

基于单细胞ATAC测序数据的乳腺癌上皮细胞转录因子研究

研究表明,乳腺肿瘤细胞染色质开放区域上的转录因子显著影响乳腺癌患者的临床表型和预后。然而,在单细胞层面,这些调控元件如何调控乳腺癌发生发展尚不明确。为此,本研究从GEO数据库中下载了45 216个正常和肿瘤乳腺组织的单细胞染色质可及性测序(single-cell ATAC sequencing, scATAC-seq)数据,并对其进行了分析。根据标记基因在细胞群的基因活性得分进行细胞类型注释后得到7种乳腺细胞类型。皮尔逊相关性分析表明,肿瘤和正常乳腺样本的上皮细胞存在明显的染色质可及性差异,且乳腺上皮细胞存在高度样本间异质性(PCC=-0.07),暗示其是乳腺肿瘤的主要恶性细胞类型。为了探究正常和恶性乳腺上皮细胞的差异可及性区域中转录因子结合基序的富集情况,在提取上皮细胞群后对4个上皮细胞亚型的特征开放区域进行了转录因子结合基序富集分析。结果表明,恶性乳腺上皮细胞有194个转录因子显著富集(P<0.001),它们可能涉及乳腺肿瘤发展和转移等调控过程。对上皮细胞亚型中富集程度较高的转录因子进行活性分数计算及转录组数据验证,结果进一步显示这些差异调控元件可能与乳腺细胞恶性发展相关。此...     

基于比较转录组分析海洋弧菌X511的褐藻胶代谢途径

【目的】从北海涠洲岛海域腐烂的马尾藻中分离得到的海洋弧菌(Vibrio X511)具有较强的利用褐藻胶能力,本文利用转录组测序的方法以研究弧菌X511的褐藻胶代谢途径。【方法】采用Illumina Hi Seq2500测序平台对菌株在褐藻胶及葡萄糖培养下的转录组进行测序;比较和分析差异转录本,利用荧光定量PCR验证测序结果;采用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异转录本进行功能和Pathway注释。【结果】经比较发现,菌株在褐藻胶培养下相对于葡萄糖的培养共有2024个差异表达基因,其中1066个基因上调,958个基因下调;某些普遍存在于代谢途径中的基因在不同培养条件下也存在差异表达;海洋弧菌X511中涉及褐藻胶利用的所有基因以及合成乙醇的关键基因其转录量均有一定程度的上调;此外,通过分析发现该菌株具有独特的褐藻胶利用方式,其中的一个代谢过程尚未在弧菌中被报道。【结论】成功解析了海洋弧菌X511的褐藻胶代谢途径,丰富了生物方法降解褐藻胶的研究,为大型海藻生物质能源的研究提供有价值的数据支持。     

单细胞转录组测序数据的细胞类型识别方法比较

单细胞转录组测序技术提供单个细胞分辨率的基因表达谱,有助于更准确地揭示细胞异质性。聚类是识别生物组织中细胞类型的主要方法,选择合适的聚类算法可以提升单细胞转录组测序数据分析的性能。本文阐述了k-means、层次聚类(hierarchical clustering, HC)、 Leiden、 SC3、 SCENA、 LAK、 SIMLR和dropClust等8种典型的单细胞聚类算法,在12个带有真实标签的单细胞转录组测序数据集上进行聚类比较分析。采用轮廓系数、 Calinski-Harabasz指数、调整兰德指数、调整互信息、 FMI指数、 V-measure、 Jaccard系数和变异系数等8个评价指标,对8种聚类算法的性能进行分析评价。根据实验结果,发现HC、 SC3、k-means、 SCENA的聚类泛用性与鲁棒性最佳,在大规模数据集上SIMLR算法表现最好;在小规模数据集上Leiden算法表现最好,但是存在依赖邻居节点参数和稳定性低的问题;dropClust算法在泛用性和鲁棒性上最差。此外,8种聚类方法的性能都与数据质量有关,当数据的变异系数较低时,聚类算法的评分指标普遍增高,反...     

利用cut&tag技术探究LHX9基因在颗粒细胞的调控机制

摘要 目的：在人卵巢颗粒细胞癌细胞株KGN中探索转录因子LHX9下游主要的靶基因及其调控。方法：首先我们采用实时荧光定量PCR观察KGN细胞在卵泡刺激素（FSH）干预前后性腺分化和性激素合成过程中重要基因的表达情况，同时我们利用cut&tag测序技术在两组细胞中识别LHX9下游靶基因，并采用双荧光素酶报告实验对重要靶基因NR5A1的调控进行了验证。结果：实时荧光定量PCR结果显示，通过加FSH处理12小时后，LHX9和NR5A1基因的mRNA水平表达降低，相反的，StAR和CYP19A1基因的mRNA水平表达增高；通过cut&tag测序技术和生物信息学分析，我们发现LHX9下游基因主要分布在内吞作用、细胞衰老、肿瘤相关通路、细胞周期、凋亡、卵母细胞减数分裂、雌激素信号转导等通路上。LHX9可以转录调控性腺分化以及类固醇激素合成的一些重要基因，其中包括NR5A1和SOX9等，荧光素酶报告基因证实了LHX9可以直接结合NR5A1基因的启动子区。结论：本研究利用cut&tag测序技术，发现转录因子LHX9对性腺分化和性激素合成的关键基因有转录调控作用，对深入理解LHX9基因对生殖系统的作用具有重要意义。     

第2个诱导肾癌的基因被发现

利用大规模“外显予组”测序,Andrew Futreal及其同事在“透明肾细胞癌”（最常见的肾癌类型）中发现了第2个经常发生突变的基因（第1个为VHL）。PBRM1（转录调控中所涉及的SWI／SNF复合物的一个成员）在约40％的病例中发生突变,被发现发挥肿瘤抑制基因的功能。     

银杏细胞转录组高通量测序及分析

利用Illumina的Genome Analyzer Ⅱx对银杏(Ginkgo Biloba)细胞转录组进行高通量测序,挖掘银杏内酯和紫杉醇生物合成基因,特别是新的羟基化酶基因,为今后最终完善红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径中未知的羟基化步骤作准备.通过测序,获得了银杏细胞69 286个contig,56 387个scaffold,32 032个unigene.Unigene平均长度636bp.另外从gap分布、GC含量、基因组coverage等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高.通过分析unigene的表达和功能注释等信息,发现66个属于CYP450基因家族,726个参与次生代谢物合成,其中59个与萜类合成有关,17个与二萜类合成相关.利用生物信息学方法从Michigan State University银杏成熟叶、侧根、成熟果实、无菌苗以及次生茎的转录组数据中找到了与银杏细胞CYP450高度同源的紫杉烷羟基化酶候选基因15个,为后续研究奠定了基础.