基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法。结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01%~0.1%。进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性。结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且q PCR法的阳性检出率为46.15%,高于DNA测序法(13.46%),阴性结果与DNA测序法的符合率为100%。此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符。上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测。     

高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌KRAS基因突变

目的:采用高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变,探讨其用于临床检测的可行性。方法:首先用高分辨率熔解曲线分析法检测64例结直肠癌患者KRAS基因第2外显子的突变情况,再用直接测序法对结果进行验证。结果:通过高分辨率熔解曲线分析法检测,发现有23例KRAS基因突变(35.9%),经直接测序法验证,证实所有患者的突变情况与高分辨率熔解曲线法的结果完全一致;共检测出6种KRAS突变类型,G12D(GGT>GAT)的突变率最高(47.8%),G12D、G12V和G13D等3种常见突变型占总突变数的78.3%。结论:与直接测序法相比,应用高分辨率熔解曲线分析法检测KRAS基因突变具有操作简单快捷、结果准确、成本低的优点,适合应用于临床检测。     

基于纳米颗粒的基因突变检测方法研究进展

基因突变是指在分子结构上发生碱基对的组成或排列顺序的改变.它与人类疾病的发生息息相关,一直以来备受关注,开发准确可靠的检测方法,进一步探索核酸功能调控以及相关疾病的早期发现和治疗是研究人员不断努力的方向.近年来,纳米颗粒因其优异的光学、电学和生物相容性,在生物医学领域得到广泛应用.首次系统地论述基于纳米颗粒在基因突变检...     

乳腺癌组织中EGFR/KRAS/BRAF基因突变检测与分析

[目的]检测乳腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)以及其下游KRAS、BRAF基因的突变类型和突变率,分析其各突变类型之间有无相关性,以期为乳腺癌药物靶点筛选和乳腺癌患者的分子靶向治疗提供更多依据。[方法]取自2016～2017年间宜昌市中心人民医院病理科收集的乳腺癌患者术后冰冻肿瘤组织样本60例以及健康人群DNA样本30例,分别提取基因组DNA,采用PCR扩增和基因测序的方法对基因组中的EGFR外显子18～21,KRAS外显子2、3以及BRAF外显子15进行基因突变分析。[结果]在检测的60例乳腺癌组织样本中,总计有8例样本存在错义突变。其中EGFR突变率为11.7%(7/60例),均为外显子18和20突变。包括第18号外显子P699A突变3例,突变率为5.0%;第20号外显子L778M、V819A突变各4例,突变率6.7%。并包含3例L778M合并V819A突变,另有2例中分别出现了I780M合并S783C和L788V合并L815F突变。BRAF外显子15仅出现了1例T599P突变,突变率为1.7%(1/60例)。30例正常人群对照组未检测到错义突变。[结论]EGFR在乳腺癌中的突变主要以外显子18和20为主,存在P699A、L778M、V819A突变且突变率高达11.7%。BRAF在乳腺癌中的突变率极低,仅为1.7%。未检测到乳腺癌组织中KRAS突变。与正常组织相比较,EGFR外显子18和20的高突变率提示其与乳腺癌的发病存在密切关系,EGFR突变是潜在的抗乳腺癌治疗靶点。     

基于核酸侵入反应的基因突变检测方法研究进展

肿瘤靶向药物治疗需要检测特异性的基因突变。尽管已开发出多种基于模板扩增的基因突变检测方法,但由于存在扩增产物交叉污 染的风险,其应用受到极大限制。基于信号扩增的核酸侵入反应,由于不存在扩增产物污染的风险,并且具有良好的单碱基识别特异性, 非常适用于基因突变的检测。因此,一系列基于核酸侵入反应的基因突变检测方法应运而生。综述若干基于核酸侵入反应的基因突变检测 方法原理与应用研究。     

基于微滴式数字PCR检测肠癌病人游离环状DNA KRAS突变的新方法

基于微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)设计一种检测肠癌游离循环DNA(Circulating cell free DNA,cf DNA)中KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog)基因突变的新方法并评估其灵敏度和准确性。根据肠癌病人KRAS基因的突变类型设计并合成,采用dd PCR扩增并评估其灵敏度和准确性;根据AMRS-PCR引物设计原理设计KRAS基因的实时定量PCR扩增引物并评估其准确性,进而比较dd PCR和q PCR二者之间的优缺点;最后针对52例肠癌病人的cf DNA采用dd PCR进行检测,研究dd PCR在cf DNA KRAS基因突变检测的应用。成功使用dd PCR和q PCR两种方法对KRAS野生型及7种突变型建立检测方法,使用质粒标准品及实际样品验证该两种方法可行并对其假阳性率、线性范围及检测下限等性能进行了评价,最后成功对52例临床患者和20例正常人的血浆cf DNA样本进行检测,临床灵敏度为97.64%,临床特异性为81.43%。dd PCR的检测性能优于q PCR,LOD达到个位数DNA拷贝,最低可确认突变浓度达到0.01%–0.04%。样本提取效率在方法学建立中也十分重要,直接影响到灵敏度和Cut Off值的判定。临床患者检测结果显示其KRAS突变率接近报道水平。     

PCR及其衍生技术在基因突变检测中的应用

许多人类遗传性疾病及某些抗艾滋病药物的抗性乃至细菌对某些抗生素的抗药性通常源于基因突变。本文对近年来在基因突变检测中应用日益广泛的各种PCR 衍生技术作一综述;重点介绍了错配PCR技术,以及我们实验室近期报道的一种快速检测喹诺酮类药物耐药大肠杆菌的错配PCR方案。 Abstract:Many inherited diseases and drug resistance have been attributed to mutations in corresponding genes.In this paper,several techniques based on PCR used in diagnosis were concluded.The development and research progress of Mismatch PCR were discussed in details.Some information about an assay that we developed for detection of antimicrobial resistance to quinolones was also described.     

幽门螺杆菌PCR检测的研究进展

幽门螺杆菌是急性、慢性胃炎、和十二指肠溃疡的致病菌,并可能与胃癌有关,因此对该菌进行检测在临床上具有重要价值,本文仅就ＰＣＲ应用于该菌检测的标本处理,引物设计,扩增步骤、扩增产物的分析和ＰＣＲ诊断的临床意义等做简要介绍。     

PCR技术检测食源性致病菌的研究进展

食源性致病菌的检测技术是食源性疾病预防与控制的关键环节。PCR是近年来广泛应用于食源性致病菌快速检测的方法之一。在食源性致病菌中,用于PCR检测的靶基因包括各种毒力基因、酶基因及特异性鉴别基因。这些靶基因的发现推动了食源性致病菌PCR快速检测的发展。     

应用高分辨率熔解曲线分析石蜡标本中KRAS基因突变

目的:KRAS基因在结直肠癌患者突变率为30％～50％,并且KRAS基因状态与抗EGFR抗体疗效的密切相关.常用的直接测序法其检测灵敏度低、容易出现假阴性结果.采用高分辨率溶解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变,探索其应用于临床检测的可行性.方法:本文收集20例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本,应用高分辨率熔解曲线方法检测KRAS基因突变(2,3号外显子).将KRAS基因突变型DNA(p.G12D)和野生型DNA梯度混合稀释,突变型DNA浓度分别为40％、20％、10％、2％,进行高分辨率熔解曲线方法进行检测,并将扩增产物进行直接测序,比较两种方法的灵敏度.结果:在20例结直肠癌患者中检出5例2号外显子突变,p.G12D 2例,p.G12V 2例,p.G13D 1例,3号外显子未检出突变.HRM方法检测基因突变的检出限可达2％,直接测序法检测基因突变的检出限为20％.结论:HRM法比直接测序法灵敏度高,能精确检测出结直肠癌石蜡标本中低浓度的KRAS突变,有望应用于临床基因突变检测.     

基因突变的检测

1985年以前对基因中显著的缺失、插入、重排,可以用Southern杂交法来鉴定。一些小的变异,包括单碱基改变,只有当它们位于限制性内切酶的切点上时,方可被检出(如RFLP,限制性片段长度多态性)。如果这些小的变异不是位于限制性内切酶的切点上,那么只有对整个的基因进行顺序测定,当然,这是费时费力的。检测基因中的未知突变较为有效的方法于1985年     

用错配PCR技术检测中国人β-地中海贫血基因突变

β-地中海贫血(β-地贫)的分子基础主要为点突变,目前中国β-地贫人群中已发现16种点突变。我们在基因频率调查的基础上,发现我国南方95％以上的β-地贫由5种点突变所致,它们是:codon 41-42(-CTTT)缺失突变,IVS-2 nt 654(C→T)突变,codon 17     

靶向KRAS治疗肺腺癌研究进展

KRAS是一种致癌驱动因子,它的突变能促进肿瘤细胞增殖,诱发肿瘤产生。KRAS突变是肺腺癌中最常见的突变,存在KRAS基因突变的肺腺癌患者数量占肺腺癌患者数的30%左右,这表明它可能是肺癌潜在的治疗靶点。近年来,针对存在KRAS突变的肺腺癌治疗进行了广泛的研究。该文首先对KRAS的分子结构、生物学功能及其在肺腺癌中的主要突变进行了阐述,然后综述了直接靶向和间接靶向KRAS突变体的肺癌治疗方案,这对于肺癌治疗候选药物的确定,评估新的靶向药物和组合,为肺癌患者提供量身定制的治疗方案具有重要意义。     

PCR检测鼠疫耶尔森氏菌研究进展

快速确诊鼠疫对鼠疫的防治工作至关重要。传统的细菌学“四步检查法”和血清学方法检测虽可确诊鼠疫,但存在烦琐、费时、费用高、不能进行快速诊断等弊病。PCR方法具有快速、特异、敏感的特点,尤其对培养条件苛刻、生长缓慢或已死亡的病原体检测优势更为明显,国内外学者现已建立了多种PCR方法用于鼠疫的检测,鼠疫PCR方法简便安全,是流行病学调查和紧急情况下检测鼠疫的有力手段。     

PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展

猪肺炎支原体(Mycopiasma hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎的重要病原,该病常引起继发感染和混合感染,严重威胁养猪业发展,造成巨大的经济损失.利用PCR技术对猪支原体肺炎早期正确诊断具有非常重要的意义.从猪肺炎支原体的特异性靶基因、临床样品采集方法与样品DNA处理方法、关键技术因素及普通PCR技术、多重PCR技术、套式PCR技术、荧光定量PCR技术、芯片检测和环介导等温扩增技术等在猪肺炎支原体检测中的研究进展、主要优缺点及应用进行综述.     

PCR技术用于HBV DNA检测的研究进展

ＰＣＲ技术自八十年代在美国问世以来,已成功地用于多种病原体的检测,八十年代末在美国成功的利用此技术对ＨＢＶ　ＤＮＡ进行了检测,我国在九十年代初也世开始了这方面的工作,并取得了成功,本文综合介绍国内外这方面的工作,并对一些具体的ＰＣＲ方法进行了详细的介绍,并对利用ＰＣＲ技术检测ＨＢＶ　ＤＮＡ时因实验设计及操作误差造成的负面影响进行了讨论。     

基于焦磷酸测序技术的 基因突变检测在精准医疗中的应用研究进展

基因突变检测在肿瘤等疾病的早期诊断、个体化给药指导、疾病治疗进程与耐药监控等方面具有极其重要的意义。随着测序技术的 不断发展,DNA 突变的检测与分析已为病毒感染、血液病和实体瘤等疾病的个体化诊治提供重要参考。焦磷酸测序技术是一种基于生物发 光法测定焦磷酸盐的实时 DNA 测序技术,其用于 DNA 序列分析时不需电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,易于实现自动化,在基 因突变检测分析与肿瘤等疾病诊治中发挥巨大作用。综述基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在分子靶向个体化治疗和疾病诊断中的应用 研究进展。     

基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展

RT-PCR、锚定PCR、cDNA末端快速扩增（RACE）、step out RACE、DDRT-PCR、cDNA代表性差异分析、抑制性削减杂交等都是建立在PCR基础之上的cDNA分子克隆技术。本介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较,这些技术现在已经成功应用于大量EST的分离、cDNA库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长cDNA基因序列的克隆等方面。     

数字PCR在生物学检测中应用的研究进展

数字PCR (digital PCR, dPCR)是在普通PCR和定量PCR基础上发展的第三代PCR技术,通过有限稀释和泊松分布统计实现精确的绝对定量检测.相比于前两代PCR技术,dPCR能够实现DNA模板的绝对定量且对PCR抑制剂具有更强的耐受性.目前,该技术在致病菌和病毒、基因突变、甲基化DNA、转基因成分和食品掺...     

基于PCR技术的miRNA定量检测方法

microRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中,不编码蛋白质的短序列RNA,它广泛参与真核生物的生长发育、新陈代谢和应激反应等生命活动。但绝大多数miRNA的生物学功能还不清楚,通过灵敏的定量检测方法,了解miRNA在不同组织部位的时空表达,是探究其功能的重要环节。现着重介绍了2类7种基于PCR技术的miRNA定量检测方法的基本原理和实验流程,并分析了这些定量检测技术间的异同和适用范围。