厌氧产氢颗粒污泥蛋白质组分析样品的高效制备方法

【背景】厌氧产氢颗粒污泥比絮状产氢污泥具有更高的生物量、沉降性与反应效率,对颗粒污泥进行蛋白质组学研究,有助于揭示其代谢调控的分子机制,从而对厌氧代谢过程进行优化调控。目前关于产氢颗粒污泥蛋白质组分析样品制备方法的研究尚未见文献报道。革兰氏阳性菌Ethanoligenens harbinense YUAN-3是自凝集产氢发酵细菌,在间歇和连续流培养中可形成自聚集的厌氧颗粒,由于其全基因组信息清楚,可作为模式研究材料对制备方法进行评估。【目的】针对厌氧产氢颗粒污泥的蛋白质组学研究,比较不同蛋白质提取方法进行优化。【方法】分别利用液氮研磨、超声破碎、匀浆破碎对产氢颗粒污泥破碎,比较这3种方法对总蛋白提取量的影响;通过双向电泳比较三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)-丙酮沉淀法与苯酚抽提法对总蛋白提取效果的影响;对总蛋白样品分别进行同位素标记相对和绝对定量标记(Isobarictagsforrelativeandabsolutequantification,i TRAQ)、串联质谱标签(Tandemmasstag,TMT)标记以及质谱鉴定。【结果】液氮研磨、超声破碎、匀浆破碎3种破碎方法下总蛋白的提取量分别是对照样品的2.0、3.9与5.2倍。与TCA-丙酮沉淀法相比,苯酚抽提法总蛋白样品在双向电泳图谱上的蛋白质点明显增多,分布均匀,同时其在碱性蛋白端与小分子量蛋白端的蛋白质点也明显增多。质谱分析发现,iTRAQ标记样品与TMT标记样品中分别鉴定到1797个与1644个蛋白,在分子量、等电点、亚细胞定位的各个分布范围内,这些蛋白良好地覆盖了E.harbinenseYUAN-3中各个类型的蛋白。【结论】匀浆破碎与苯酚抽提法联用的总蛋白制备方法更适用于厌氧产氢颗粒污泥,该方法有利于后续的蛋白质双向电泳和定量蛋白质组质谱分析,可作为产氢颗粒污泥以及革兰氏阳性菌总蛋白制备的方法参考。     

汾酒大曲宏蛋白质组的制备与双向电泳技术的建立

采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀、硫酸铵等沉淀法制备汾酒大曲的宏蛋白组样品,并用双向电泳来检测制备效果,结果表明：TCA-丙酮沉淀法制备的样品经电泳分离后,减轻了杂质干扰,其2-DE图谱中竖条纹干扰较少,且获得的蛋白点形状规则、清晰且无明显重叠现象,优于其它两种方法;经过两次水化液溶解的蛋白样品在等电聚焦时能保持4000 V较高电压;上样量为300μg左右的粗蛋白溶于二次水化液能得到点数更多、分辨率高的电泳图谱。建立了汾酒大曲宏蛋白质组的双向电泳体系,为汾酒品质研究奠定基础。     

珍珠黄杨叶片的蛋白质提取方法探讨

蛋白质样品制备是双向电泳的核心.为了找到一种适合提取珍珠黄杨叶片蛋白质的方法,本文以该树种扦插苗的叶片为材料,用TCA-丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法和2-D Clean-up Kit提取蛋白质,并进行双向凝胶电泳,采用银染法进行检测.结果表明,TCA-丙酮沉淀法得到的样品图谱背景模糊、拖尾;Tris-饱和酚法得到的样品图谱清晰,蛋白点饱满,无纵向或横向拖尾,但有蛋白点丢失;2-D Clean-Up Kit提取的蛋白质样品得到了较好双向电泳图谱.     

小菜蛾蛋白质提取方法的比较

建立适用于小菜蛾蛋白质组学研究的样品前处理方法。应用SDS-PAGE电泳比较分析了TCA-丙酮沉淀,Tris-饱和酚抽提,RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent直接裂解4种方法对小菜蛾幼虫总蛋白的抽提质量。结果显示:4种方法对小菜蛾全蛋白的提取率差异比较显著,其中RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent两种直接裂解法蛋白提取率最高,分别为52.06 mg/g和46.16 mg/g;TCA-丙酮沉淀法提取率适中,为34.58 mg/g;Tris-饱和酚抽提法提取率最低,为27.39 mg/g。SDS-PAGE电泳分析表明,Tris-饱和酚抽提法蛋白谱条带分辨率最高,蛋白条带最多,为32条,在17.0 k Da-245 k Da的范围内分布均匀;TCA-丙酮沉淀法蛋白谱带数目为30条,条带清晰,分辨率较高,但缺失部分蛋白;RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent两种直接裂解法蛋白谱条带数目较少,小分子蛋白条带丢失或不明显。根据蛋白提取率和条带的数量综合分析,TCA-丙酮沉淀法适用于小菜蛾蛋白质组学的样品前处理。     

丙酮丁酸梭菌胞浆蛋白质组的系统研究

为了建立丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)蛋白质组的研究方法,采用超声波破碎细胞,并结合丙酮沉淀分离蛋白的方法,提取丙酮丁醇梭菌胞浆蛋白质,发现加入罗氏蛋白酶抑制剂能有效地减少提取过程中蛋白质的降解。通过二维电泳技术对其胞浆蛋白进行有效分离,在pH 4～7的胶上分离出大约1230个蛋白点。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱成功鉴定了19个蛋白质。这些蛋白质组研究方法对于缺少蛋白质组研究的梭菌属具有一定的参考价值。     

溶藻菌R1的分离鉴定以及对栅藻共处代谢的影响

【目的】分离并鉴定溶藻菌和栅藻,并对溶藻菌抑制栅藻的机理进行分析。【方法】溶藻菌分离采用高氏一号培养基,经多次划线纯化而得;溶藻菌鉴定采用生理生化性质判定;栅藻分离和鉴定主要采用镜检和《中国常见淡水浮游藻类图谱》完成;溶藻菌对栅藻的影响分析测定包括:测定栅藻叶绿素a变化、水体中溶解氧变化、藻细胞数目变化、藻蛋白表达变化、抑藻特殊物质测定等。【结果】共分离出4株溶藻菌(R1-R4),通过对其理化性质测定初步判定均属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),其中溶藻菌R1对栅藻生长的影响最明显,其对栅藻叶绿素a的抑制率为65%、溶解氧最低达6.5 mg/L,远低于栅藻单独培养下的10.4 mg/L;栅藻单独培养条件下的蛋白质表达为0.845 7 mg/L,与溶藻菌R1共培养时栅藻蛋白表达仅有0.192 6 mg/L;傅里叶红外光谱(FTIR)测定表明溶藻菌对栅藻细胞结构产生影响;相差显微镜对溶藻菌R1-栅藻共培养动态观察图可以看出,溶藻菌R1对栅藻的生长具有明显的抑制作用。【结论】从影响栅藻细胞结构、栅藻蛋白表达、栅藻光合作用等方面进行了分析,为揭示溶藻菌对栅藻抑制的机理提供了一定的理论基础。     

模式生物黑腹果蝇蛋白质组双向电泳条件优化

黑腹果蝇是生命科学领域研究常用的经典模式生物。本研究以黑腹果蝇为样品,在总蛋白提取、蛋白纯化和等电聚焦条件等三个方面对果蝇蛋白质组双向电泳条件进行优化,为果蝇比较蛋白质组学研究奠定基础。结果显示:(1)蛋白提取:利用Bullet Blender细胞组织破碎仪处理样品优于超声破碎及液氮研磨;(2)蛋白纯化:利用2D-clean up试剂盒纯化蛋白效果较好;(3)等电聚焦:等电聚焦总volt-hours在15 000 volt-hours左右时竖条纹相对较少;通过综合优化后的双向电泳技术所得到的蛋白图谱中蛋白点相对较多且圆滑,条纹现象较轻,重复性较好,满足后续软件分析以及数据处理的要求,适用于黑腹果蝇以及其他蝇类的蛋白质组学研究。     

一种高效的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法

灵芝基因组精细图谱的完成必将推动灵芝蛋白质组学的快速发展,因此,建立一种高效稳定的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法是蛋白质组学研究的首要步骤。本文以灵芝菌丝为研究对象,使用超声波、液氮冷冻研磨和超声波联合液氮冷冻研磨等三种破碎细胞壁的方法,采用含不同蛋白酶抑制剂的尿素-硫脲法溶解菌丝体总蛋白,经SDS-PAGE电泳分析和蛋白浓度测定,发现液氮冷冻研磨结合尿素-硫脲溶解蛋白质的方法适合灵芝菌丝体总蛋白的提取,从每克新鲜菌丝中能提取16 g蛋白质,且蛋白质种类多,条带丰度高。     

适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究

以‘铭贤169'小麦苗期叶片为材料,分别采用传统的TCA/丙酮沉淀法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法以及改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取叶片总蛋白,进行双向电泳分离和胶体考染,以建立适用于小麦蛋白质组分析的样品制备方法.结果表明:TCA/丙酮沉淀法较酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法获得的蛋白杂质较少,在二维电泳图谱中的蛋白点较酚抽提-甲醇/醋酸铵沉淀法提取的蛋白点清晰且多.相比于以上2种提取蛋白样品方法,改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取的小麦叶片蛋白杂质少、二维电泳图谱上的点明显增多、分辨率较高.所选小麦的代表性蛋白点能获得成功鉴定.该方法可推广应用于水稻叶片蛋白质组分析的样品提取.     

不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定

采用液氮研磨与超声波破碎相结合的方法,破碎不同失水状态的发菜藻体和细胞,用差速离心法制备发菜类囊体膜粗制品,蔗糖密度梯度高速离心纯化类囊体膜,SDS-PAGE电泳分离类囊体膜蛋白,并对膜蛋白进行了MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析和鉴定。结果表明:(1)充分吸胀4h后失水6h的发菜(含水量51.2%)和失水24h的发菜(含水量14.9%),经过多步差速离心后再进行蔗糖密度梯度高速离心,可得到纯化的类囊体膜。(2)发菜类囊体膜蛋白SDS-PAGE电泳分离到14个条带,共鉴定出8种蛋白,根据其功能可分为4类——光合作用相关蛋白(光系统Ⅱ锰稳定蛋白PsbO,F1F0 ATP合成酶α亚基和β亚基)、结构域蛋白、选择性通道蛋白OprB、未知蛋白(hypothetical protein Npun_R1321、Npun_R3785、N9414_02186),它们在发菜的光合作用中具有重要作用。     

一种适合稻水象甲双向电泳的蛋白质提取方法

【背景】蛋白样品制备是2-DE蛋白组学研究的关键步骤,无杂质、高纯度的蛋白样品是获得良好的2-DE结果的基础。选择合适于昆虫蛋白组学研究的常规蛋白提取方法是2-DE研究的前提。【方法】通过饱和酚法和TCA-丙酮法提取稻水象甲成虫总蛋白,比较2种方法的优缺点,以回避昆虫组织蛋白提取时可能出现的问题。【结果】TCA-丙酮法的蛋白质产率(14.55μg·mg-1)显著高于饱和酚法(9.30μg·mg-1),2种方法获得的SDS-PAGE条带结果相近,且高丰度表达蛋白在TCA-丙酮中更高表达;饱和酚的2-DE图谱蛋白点清晰,TCA-丙酮法2-DE图谱蛋白点规则但背景模糊,出现多条横纹。【结论与意义】饱和酚法适合稻水象甲成虫蛋白组学的研究。这2种方法也能适用于其他昆虫,但不同的昆虫体内有不同的干扰组分来干扰蛋白质的提取,所以获得的蛋白纯度及提取得率可能并不一样。试验结果说明了2种蛋白提取方法对2-DE研究的影响,并为稻水象甲成虫的蛋白组学研究提供了一定的参考依据。     

增强UV-B辐射对拟南芥叶肉细胞蛋白的影响

采用不同剂量的UV-B辐射处理4周龄的野生型拟南芥幼苗(Columbia-0),分别采用丙酮沉淀法和TCA-丙酮法提取其叶肉细胞中的蛋白质,进而研究分析拟南芥叶肉细胞中蛋白质的含量与组成对不同强度UV-B辐射的响应。结果显示,两种方法相比较,TCA-丙酮法所提取得到的蛋白含量相对较多,更适合于分析增强UV-B辐射对拟南芥叶肉细胞蛋白质的影响;而两种方法所提取得到的蛋白质含量的变化趋势相同,随着UV-B辐射剂量的增加,蛋白质含量呈先增加后减少的趋势,B₂组达到了最大。此外,蛋白条带的数目和表达量也都发生了显著变化,同样也是以中剂量处理组（B₂组）变化最为明显,既有新增条带,又有消失条带。这可能是由于拟南芥在受到低剂量的UV-B辐射时,可以激活自身一些抗性基因的表达而诱导产生抗性蛋白,进而抵御UV-B的伤害;而当受到高剂量的UV-B辐射时,损伤自身的蛋白质合成途径,影响蛋白的合成。     

油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进

以甘蓝型油菜"扬油6号"的叶片为试验材料,分别采用传统的TCA/Acetone(三氯乙酸/丙酮沉淀法)和改进的PEG(polyethylene glycol)分步提取法提取叶片可溶性总蛋白,并利用条件一致的蛋白质双向电泳体系进行比较。TCA/Acetone法提取的蛋白质双向电泳图谱背景中由于高丰度"housekeeping"结构蛋白的存在,特别是叶片中参与光合作用的Rubisco蛋白的干扰,图谱中低丰度调控蛋白受到了高度覆盖和遮蔽现象,影响双向电泳图谱的质量。而PEG分步提取法提取的蛋白质样品,可以剔除Rubisco蛋白,使获得的双向电泳图谱清晰,无斑点间的遮蔽现象,为油菜叶片蛋白质组定量和定性分析提供了丰富的信息。     

五种淡水微藻的适宜培养温度和光照强度

从淡水中分离得到绿球藻(Chlorococcum sp.)SHOU-F3、纤维藻(Ankistrodesmus sp.)SHOU-F33、小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F46、空星藻(Coelastrum sphaericum)SHOU-F10和栅藻(Scenedesmus sp.)SHOU-FX,分别在光照培养箱中研究了温度、光照强度对5种微藻增殖的影响,并分析了5种微藻的细胞组成。结果表明:绿球藻SHOU-F3、纤维藻SHOU-F33、小球藻SHOU-F46、空星藻SHOU-F10和栅藻SHOU-FX的最适生长温度分别为29.8、23.5、31.4、34.4和24.7℃;最适光照强度分别为16、119、42、82和106μmol·m-2·s-1;在适宜培养条件下,绿球藻SHOU-F3的色素、蛋白以及总糖的百分含量最高,纤维藻SHOU-F33的脂肪百分含量最高。     

表面活性剂CTAC和STAB对四尾栅藻的毒性效应

采用室内培养法考察了十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和十八烷基三甲基溴化铵(STAB)对四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)的生长状况、蛋白质含量、叶绿素含量、脂质过氧化丙二醛(MDA)含量以及超氧化歧化酶(SOD)活性的影响,分析了CTAC和STAB对四尾栅藻的毒性机理。结果表明:CTAC和STAB对四尾栅藻的生长抑制效应受浓度和时间的影响显著,STAB对四尾栅藻的毒性大于CTAC,且CTAC和STAB作用4d内,藻种蛋白质、叶绿素含量以及SOD酶活性均先上升后下降,MDA含量下降。根据5种指标变化与CTAC(或STAB)之间呈现的浓度-效应关系和时间-效应关系推测,表面活性剂对藻细胞的最初攻击点是通过改变其细胞膜膜脂分子的水溶性,破坏四尾栅藻的细胞膜;表面活性剂通过刺激细胞产生活性氧自由基引起脂质及其他生物大分子的氧化损伤可能是其对四尾栅藻产生毒害效应的主要机制。     

一种适用于双向电泳分析的高效真菌线粒体提取及蛋白质制样方法

用液氮冷冻研磨法破碎真菌菌丝细胞,通过差速和蔗糖密度梯度离心分离纯化板栗疫病菌线粒体,所得线粒体产率(质量比)约为1/10~4。电子显微镜观察和蛋白印迹表明,所制备的线粒体完整性好,没有检测到其它细胞成分的污染。使用膜蛋白裂解液溶解线粒体制备蛋白样品,将蛋白样品200μg上样于pH3~10,24cm的非线性胶条进行等电聚焦,电聚焦后再进行第二向SDS-PAGE电泳分离,经银染获得重复性好、背景清晰、分辨率高(680±15个蛋白质点)的凝胶图谱。随机选择10个蛋白质点进行质谱分析,9个获得有效注释,均为线粒体特异性蛋白质,表明所制备的蛋白样品非常适合双向电泳分析及其后续的质谱鉴定。     

板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件,从蛋白组学角度来探索板栗疫病菌致病性机理,比较了目前在丝状真菌中常用的两种蛋白质提取方法,制备的蛋白质样品经双向凝胶电泳后,在凝胶上呈现的蛋白质斑点的丰度和分布特点。结果表明,两种方法获得的蛋白质主要集中分布在pH4~7的范围内;TCA-丙酮沉淀法得到的图谱分辨率高但是蛋白质总量很少。裂解液-TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白质总量较大,通过cleanupkit处理后图谱分辨率可以达到差异蛋白组的要求。随机提取几个银染蛋白点用MALDI-TOFMS/MS进行分析,可以得到高质量的肽质量指纹谱。表明该样品制备方法可以满足蛋白质鉴定的要求。     

姜老师信箱

<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我第十九期蛋白质分离纯化研讨班的学员。上课时您讲到渗透压冲击法破碎大肠杆菌比超声破碎可以降低1个数量级的杂蛋白,我有以下几个问题请教:1.使用这种方法如何区分是包涵体还是可溶性表达,是否跟超声破碎一样:破碎菌体后离心,分别取上清和沉淀跑SDS-PAGE?2.这种方法对包涵体表达是否适用?     

苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立

为了建立适于苹果属植物树皮组织总蛋白提取的技术方法, 以8年生华月苹果(Malus domestica)树枝条为试材, 通过比较不同提取方法(TCA-丙酮沉淀法(A)、甲醇/醋酸铵沉淀法(B)和改良的Tris-酚抽提方法(C))并优化提取条件, 确立了最适提取及分离方法为改良的Tris-酚抽提方法。在2-DE分离时, 该方法所获得的样品图谱中蛋白点总数为993个, 明显多于TCA-丙酮沉淀(418个)和甲醇醋酸铵沉淀(674个)方法, 并且与其它两种方法相比, 该方法获得的图谱背景更清晰, 蛋白点聚焦效果更好。此外, 经过3个梯度上样量的图谱分离效果比较, 确定了800 μg为本研究中2-DE分析的理想上样量。另外, 为了验证该提取及分离方法的可行性, 进一步对蛋白质表达谱中的部分蛋白点进行了质谱分析, 且这些蛋白点均得到了成功鉴定。该研究通过优化总蛋白提取方法及样品上样量等条件, 获得了理想的双向电泳分离图谱, 为苹果属植物树皮组织材料的蛋白质组学研究奠定了基础。     

盐度对一株淡水栅藻Scenedesmus sp.生长及生化组成的影响

通过管式光生物反应器培养,分析比较不同盐度(0-40‰)对一株淡水栅藻(Scenedesmus sp.)生长和生化特性影响,评价海水培养该藻株的产业化潜力,探讨其高盐适应机制,为进一步海水驯化研究提供理论参考。采用显微观察、索氏提取法、凯氏定氮法、苯酚硫酸法、气相色谱法及高效液相色谱法分别测定微藻生长及蛋白质、油脂、多糖含量以及色素、脂肪酸组成情况。结果表明,高盐条件下藻细胞明显增大,并出现自然沉降现象,可实现低成本采收。随盐度增加,栅藻生长逐步被抑制,40‰盐度条件下生长完全停止,但在3‰盐度下仍良好生长,培养末期生物量可达2.84 g/L。30‰盐度组蛋白质含量相对淡水组提高95.40%、产率与淡水组相近,加之高盐培养可较大幅度降低蛋白质的生产成本,因此,采用海水培养栅藻来开发蛋白资源具有一定的潜力。研究还表明,30‰盐度下藻细胞内β-胡萝卜素、虾青素、可溶性多糖等成分大量积累,可能是其适应高盐胁迫的重要生理基础。