小鼠Agouti基因变异及生物信息学分析

目的分析候选基因Agouti的多态性,揭示染色体工程小鼠毛色差异的分子机制。方法首先,用测色仪检测小鼠的毛色差异。其次,利用DNA芯片进行全基因组扫描确定候选基因Agouti。最后,运用生物信息学软件分析Agouti基因cDNA序列和氨基酸序列的多态性,预测突变对蛋白结构和功能产生的影响。结果发现Agouti基因cDNA序列上存在5个SNPs,使Agouti信号蛋白产生了3个错义突变。生物信息学分析发现,其中一个错义突变使该蛋白丢失了一个β折叠,并且其三级结构发生改变,最终导致与受体结合的能力相较于野生型有所下降。结论在毛色基因Agouti的编码区发现了一个新的错义突变,该突变使Agouti信号蛋白与受体结合能力下降,最终导致小鼠的毛色由浅灰色变为深灰色。     

藏獒MC1R基因多态性与毛色表型的关联研究

目的:通过检测藏獒黑素皮质激素受体1(MC1R)基因的单链构象多态性(SSCP)在不同毛色群体中的分布,探讨MC1R基因多态性与毛色表型的相关性。方法:采用DNA测序技术,选择不同毛色藏獒的DNA为样本,根据GenBank发布的荷斯坦牛MC1R基因序列设计一对引物,采用PCR-SSCP技术分析MC1R基因在藏獒中的SSCP。结果:MC1R基因在藏獒中具有PCR-SSCP多态性,分别检测到3种基因型(AA、AB和BB);对MC1R基因多态性片段DNA克隆测序后发现,MC1R基因在编码区第313位存在单碱基突变(G→A),该突变导致第105位氨基酸发生由丙氨酸向苏氨酸的改变(T105A)。结论:MC1R基因的多态性与毛色性状不存在显著的相关性。     

组蛋白修饰对酿酒酵母复制起始相关蛋白基因表达的调控

真核生物的DNA复制是一个复杂且有序的过程,其中DNA复制起始参与调控众多生物学活动,对生物正常的生长发育具有重要作用。组蛋白修饰在调节DNA复制过程中具有重要作用。为了检测组蛋白特定位点的修饰对DNA复制起始的影响,本研究以酿酒酵母组蛋白H3/H4定点突变菌株为研究对象,采用倍比稀释表型分析法检测了组蛋白11种H3/H4甲基化、乙酰化突变菌株的生长情况,显示,以野生型菌株BY4741为对照,组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K64A、H3K56A、H3K14Q、H4K5R、H4K16Q以及组蛋白H4甲基化突变菌株H4K20Q表现为生长缺陷,其他菌株与BY4741生长情况基本一致;通过GeNorm和NormFinder软件分析得出本实验最适内参基因为β-actin;采用Real-time PCR检测了菌株细胞内复制起始相关蛋白基因mcm2、mcm10、cdc45的表达情况,表明,组蛋白H3/H4甲基化突变菌株H3K9A、H3R72K、H4K59A、H4K20Q胞内mcm2、mcm10、cdc45基因表达均显著下调(p0.01),而H4R3A胞内mcm2、mcm10表达显著上调(p0.05)、cdc45显著下调(p0.01),组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K14Q、H4K5R、H4K8A、H4K16Q胞内mcm2表达显著下调(p0.01),而在H3K64A、H3K56A胞内无显著变化,mcm10在6种组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株内表达均下调(p0.01),cdc45基因在H4K5R胞内表达无显著变化,在其余5种乙酰化突变菌株中表达均显著下调(p0.01),为进一步阐明组蛋白特定位点修饰调控DNA复制起始的深入研究提供理论帮助。     

中国地方猪种黑素皮质激素受体1基因(MC1R)的单核苷酸多态性

以黑素皮质激素受体1基因作为影响猪毛色性状的候选基因, 应用PCR-SSCP(单链构象多态)法对11个中国地方猪种该基因的编码区进行单核苷酸多态性检测. 作为比较, 还研究了3个引入猪种. 结果发现11个品种的所有个体都存在3个突变: G284A, T309C和T364C, 与以往报道中欧洲大黑猪发生的突变相同, 推测中国地方猪种的毛色属于显性黑毛色性状. 而3个引入猪种发生的突变为68CC, C492T, G728A, 与地方猪种有明显区别, 二者分属截然不同的毛色遗传体系. 黑素皮质激素受体1基因对于中国地方猪种之间毛色的差异没有起到关键的影响作用, 但是它可为猪的分子进化研究提供一定的凭据.     

黑色素皮质素受体1基因对水牛毛色遗传的影响

MC1R在很多动物的色素沉积过程中发挥关键作用。为了阐明MC1R基因是否与水牛毛色性状相关,本研究对216头遗传背景清楚的水牛进行了该基因编码区DNA序列测定。研究的样品包括49头黑色河流型水牛（包括摩拉水牛和尼里-拉菲水牛）,136头毛色为灰色或白色的沼泽型水牛（包括德宏水牛、滇东南水牛、德昌水牛、贵州水牛和西林水牛）和31头尼里-拉菲水牛或摩拉水牛与沼泽型水牛的杂交后代。序列分析发现在水牛群体中存在3个单核苷酸突变位点（SNPs）,其中SNP684是同义替换,而SNP310和SNP384为非同义替换,并分别导致p.G104S和p.M128I氨基酸的改变。只有基因型为河流型等位基因纯合子胪铲的个体毛色表型为黑色。对黑色河流型水牛与灰色沼泽型水牛的杂交后代基因型和毛色表型的分析进一步揭示：河流型等位基因E^BR或编码p.104S的等位基因对保证MC1R具有正常功能起重要作用。生物信息学功能分析显示,p.G104S和p.M128I两个氨基酸替换对MC1R的功能有显著影响,进一步支持矿。等位基因或编码p.104S的等位基因与水牛黑色性状相关。     

应用BXD小鼠鉴定肾脏发育相关QTLs

[目的]利用BXD小鼠群体定位肾脏发育相关QTLs及筛选QTLs区段内的候选功能基因。[方法]高脂饲喂BXD小鼠29w龄后,获取各品系小鼠肾脏重量和体重,结合该小鼠群体基因型信息,利用web QTL定位肾重比相关QTLs。为进一步筛选QTLs区段内的功能基因,首先,通过皮尔逊相关性分析,鉴定肾脏mRNA表达水平与肾重比显著相关(P 0. 05)的基因;其次,通过比较C57BL/6J和DBA/2J亲本品系的DNA序列信息,鉴定含有非同义突变的蛋白编码基因;最后,将上述基因导入到Phenolyzer在线分析数据库,并以"kidney"为表型关键词进行检索,优选QTLs区段内的候选功能基因。[结果]BXD小鼠肾重比存在显著差异。经QTL作图,在基因组上共鉴定3个与肾重比相关的QTLs,分别位于四号和X染色体上。在QTLs区段内,共发现45个基因的肾脏mRNA表达水平与肾重比显著相关(P 0. 05),65个基因含有非同义突变,经Phenolyzer在线数据库分析,发现51个基因可能与肾脏发育或肾脏疾病相关。[结论]通过QTL作图,在小鼠基因组上鉴定了3个影响肾脏发育的QTLs,筛选了部分候选基因,后续可做进一步的功能验证来阐明其参与肾脏发育的调控机制。     

London/Swedish双突变APP转基因小鼠的鉴定

鉴定及评价APP双突变阿尔茨海默病的转基因小鼠模型。方法将London/Swedish双突变APP基因插入到PDGF启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立APP695^V652I/K596N/M597L双突变转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定APP695双突变转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Western blotting检测APP突变基因表达,免疫组化检测APP695双突变转基因小鼠大脑病理改变。水迷宫检测APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠的行为学改变。结果建立了2个品系的人APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠。抗Aβ1-17免疫组织化学显示APP695双突变转基因小鼠海马区阳性细胞数较APP695^V652I单突变转基因小鼠,及野生小鼠阳性细胞数明显增多,胞膜着色明显加深。双突变转基因小鼠在5月龄时可检测到老年斑。行为学检测显示APP695^V652I/K596N/M597L双突变转基因小鼠学习记忆能力比APP695^V652I单突变转基因小鼠有明显下降。结论APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠较APP695^V652I转基因小鼠更早出现老年斑及学习认知能力障碍。成功建立了人APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠阿尔茨海默病模型,为研究阿尔茨海默病发病机制和药物研发提供了有价值的动物模型。     

TNNT3~（R69H）突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-TNNT3（R69H）转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3（R69H）注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达。结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠。对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3（R69H）在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。     

(GTG)5探针产生的DNA指纹图在近交系小鼠遗传检测中的应用

目的探讨用非放射性标记的寡聚核苷酸探针(GTG)5进行近交系小鼠的DNA指纹分析。方法用非放射性标记的寡聚核苷酸探针(GTG)5制作BALB/c、C57BL/6J、DBA/2、C3H近交系小鼠的DNA指纹图,对这四个品系的小鼠进行遗传检测,分析各品系内和品系间的遗传变异性。结果(GTG)5探针可产生具有良好多态性的DNA指纹图,平均图带数为8~12条。各品系内的DNA指纹图平均相似系数(-x)在0.96~1.00的范围内,具有相同指纹图的概率(P)均在3.1×10-1以上,极显著地高于品系间的相似系数(0.22~0.39)和相同指纹图的概率(P<1.07×10-4)。结论(GTG)5可用于制作近交系小鼠的DNA指纹图以对其进行遗传检测。     

利用CRISPR/Cas9技术构建定点突变小鼠品系

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制,建立基于CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外,利用HR介导的修复机理,将黄素单加氧酶3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F₀小鼠基因测序分析显示,成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠,这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式,成功构建了特定位点突变的小鼠品系。     

小鼠39个微卫星的PCR条件及其运用

目的探索小鼠基因组39个微卫星的PCR条件,评价微卫星在小鼠遗传检测中的运用.方法采用梯度法探索39个微卫星的PCR条件;选择本中心不同来源及引种时间的C57BL/6、BALB/c、DBA/2J、CBA/N、FVB/NJ、ICR共6个品系(8个组)小鼠,每组采用10只个体的鼠尾,提取DNA并混合成DNA池,用39个微卫星扩增后电泳观察、比较种系纯度.结果小鼠微卫星的PCR条件差异较大,Mg2+浓度多数在1.5 mmol/L左右,退火温度多数在59℃左右.在6个品系小鼠的39个微卫星位点中,C57BL/6、BALB/c、DBA/2J都是纯合的; 其余品系有1～3个杂合位点. BALB/c在D5Mitl68、D8Mit320、D13Mit262三个位点,DBA/2J在D14Mit205位点与数据库记录有差异.结论本研究为小鼠39个微卫星提供了候选的PCR条件,并对6个品系小鼠的微卫星概貌及微卫星的运用价值进行了探讨.     

乙型肝炎病毒3′末端缺失的preS/S基因在转基因小鼠中的表达

从乙型肝炎病毒adr亚型的基因组DNA中分离3′末端缺失的preS/S基因的DNA片段,构建了由CMV启动子控制的真核表达载体。采用受精卵显微注射方法,获得了基因组整合有3′末端缺失的preS/S基因的2个转基因小鼠品系。在不同的时间点采取血清进行了ELISA分析,发现在这2个小鼠品系中3′末端缺失的preS/S基因可被表达,而且呈稳定状态。此小鼠品系的建立,对于探讨乙型肝炎病毒3′末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间的关系有重要意义。     

大鲵Agouti基因的克隆、表达及多态性分析

刺鼠信号蛋白(Agouti)是哺乳动物和鸟类黑色素合成过程中的重要调控因子,影响动物的体色(毛色)。为研究Agouti在两栖动物体色形成过程中的作用,本研究利用PCR技术扩增得到大鲵Andrias davidianus的Agouti基因部分cDNA序列并进行了相关的生物信息学分析,进一步使用实时荧光定量PCR检测了大鲵Agouti基因在皮肤、肝脏等10个组织和器官中的表达情况,并检测了4种不同体色大鲵皮肤组织中Agouti基因的表达量。同时采用直接测序法,比较了不同体色大鲵Agouti基因编码区的序列差异。结果显示,大鲵Agouti基因cDNA序列长1 068 bp,开放阅读框399 bp,编码132个氨基酸残基。蛋白质同源性分析表明,大鲵Agouti蛋白具有与其他物种一致的保守Agouti结构域,其蛋白质序列与两栖爬行类序列相似性较高,与哺乳动物和鸟类相似性较低。系统进化分析显示,大鲵Agouti基因与高山倭蛙Nanorana parkeri、美国短吻鳄Alligator mississippiensis、中华鳖Pelodiscus sinensis等物种的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,Agouti基因mRNA在大鲵不同组织中均有表达,皮肤中的表达量最高。在4种不同体色大鲵皮肤组织中,黄色皮肤中的Agouti基因表达量高于其他体色。不同体色大鲵Agouti基因编码区序列一致。大鲵Agouti基因独特的序列特征及其表达的组织特异性暗示了其在两栖动物体色形成过程中可能具有与其他物种不同的调控机制。这些结果为进一步研究Agouti在大鲵体色形成过程中的作用提供了基础资料。     

MC1R基因多态性与豚鼠隐性黄毛色的相关性分析

豚鼠Cavia porcellus的隐性黄毛色表型是由编码黑素皮质激素受体1(MC1R)的extension基因座位的等位基因e控制。本研究对野生型和黄毛色豚鼠MC1R基因位点所在区域进行PCR扩增与测序发现,在黄毛色豚鼠中存在1个2 760 bp的基因组缺失,该缺失涵盖了MC1R基因的整个编码区。采用三引物扩增体系对豚鼠MC1R基因缺失突变进行群体基因分型,在随机选择的58只野生型个体中,36只为EE纯合子,22只为Ee杂合子,而31只黄毛色个体均为ee纯合子;在15只测交后代中,8只黄毛色个体均为ee纯合子,而7只野生型个体均为Ee杂合子。基因分型结果表明,MC1R基因2 760 bp的缺失与隐性黄毛色完全相关。本研究为进一步探究MC1R基因在哺乳动物毛色遗传机制中的作用以及豚鼠的分子标记辅助育种提供了理论依据。     

MC4R、POU1F1基因对京海黄鸡生长性能的遗传效应

以MC4R和POU1F1基因为候选基因, 采用PCR-SSCP和DNA测序技术检测两个候选基因在京海黄鸡群体中的单核苷酸多态性(SNPs), 同时对候选基因与京海黄鸡生长性能的相关性进行了研究。结果表明, MC4R基因编码区第662 bp位置有G→C碱基的点突变, 在京海黄鸡中检测到AA、AB、BB 3种基因型, A等位基因频率为0.929, B等位基因频率为0.071; 在POU1F1基因exon3在序列的第5 231 bp位置有一个A→T碱基的点突变, 检测到CC、CD、DD 3种基因型, C等位基因频率为0.500, D等位基因频率为0.500。采用GLM模型分析基因型对生长性能的遗传效应, 结果表明, MC4R基因AA基因型个体的4、8、12周龄体重显著地高于BB型个体(P<0.05), 16周龄体重差异极显著(P<0.01); POU1F1基因CD基因型个体体重极显著高于CC型和DD型(P<0.01)。因此推测MC4R和POU1F1基因可能是影响鸡生长性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因, 能够在分子标记辅助选择中用于对鸡生长性状的遗传改良。     

SNP标记对角膜混浊小鼠 突变相关基因的精细定位

为深入研究前期工作中以ENU诱变技术建立的遗传性角膜混浊突变系小鼠(B6-Co)的遗传机制, 利用 SNP标记对其突变基因进行精细定位, 将该品系中具有角膜混浊表型的小鼠(B6-CoP)与DBA/2小鼠(简称D2)配种得到F₁代, 再回交D2亲本品系得到F₂代, 提取F₂代角膜混浊小鼠鼠尾DNA。在MGI数据库中选取小鼠13号染色体已定位区间附近5个在C57BL/6(简称B6)和D2两个品系之间有差异的SNP, 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术及连锁分析方法对B6-Co小鼠突变基因进行精细定位。结果表明: B6-Co小鼠突变基因定位于13号染色体上112 546 283~113 397 654 bp之间, 因该区间内有5个已知基因, 其中Map3k1基因与小鼠眼睛形态生成和眼睑闭合密切相关, 提示Map3k1是B6-Co小鼠突变的强力候选基因。     

13例肝豆状核变性家系致病基因突变的检测和分析

为了研究Wilson病(wilson disease,WD)基因突变的类型和发生情况,探讨WD疾病的病因、临床特点,通过采用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)方法结合DNA测序方法对13例无亲缘关系的患者及33住亲属进行A TP7B基因所有外显子及5'端非转录区突变检测.33例DNA标本确认11种基因突变,其中包括9种错义突变(p.R778L、p.R919G、p.T1178A、p.T977M、p.K1010Q、p.C490TERM、p.A874P、p.G943S、p.G943D),1种缺失突变(2790delCAT),1种剪切位点改变(c.1708-1G＞C (intron 4 +1 G＞C)).在13个家系中,发现4例R778L突变,2例2790delCAT,均为杂合型突变,涉及17个等位基因,本组检出率为70.8％(17/24).DHPLC-测序法是WD疾病基因突变筛查较为快捷、全面而且敏感的方法.WD基因突变存在热点区分别为3、8、12号外显子.2790delCAT、p.K1010Q、c.1708-1G＞C (intron 4+1 G＞C)是ATP7B基因新突变类型,p.S406A、p.V456L、p.V 1140A、p.R952K是中国人比较常见的多态类型.     

HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答

构建编码HBV包膜-核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗pHBs、pHBc,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应,比较融合基因DNA疫苗与单基因DNA疫苗诱生免疫应答的强度,发现融合基因DNA疫苗诱生抗体的效率明显不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强、更持久的细胞免疫应答,表明HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗对于治疗慢性乙型肝炎可能比单基因DNA疫苗更为有效.     

定位于1p36.12～1p35.1 的良性家族性婴儿惊厥家系 8 个候选基因的排除克隆*

目的:克隆定位于1p36.12～1p35.1上微卫星标志D1S2864和D1S2830之间12.4cM的区间内的腓骨肌萎缩症2L型的致病基因。方法:应用生物信息学方法筛选8个候选基因(NHE1、SMN、STX12、OX1R、BDR2、DHHC18、FLJ10315和SESN2),设计合成扩增8个基因外显子及外显子与内含子交界的引物,DNA直接测序法进行序列变异分析。结果:未发现与BFIS共分离的致病突变,但发现3个已知的多态。结论:排除了8个候选基因为该BFIS致病基因的可能。     

NisinZ的定点突变及突变体性质的研究

以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ201为模板,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第8位Thr突变为Ser（T8S）、将第2位Dhb突变为Dha和第31位His突变为Lys（T2S/H31K）以及将第27位Asn突变为Lys和第31位His突变为Lys（N27K/H31K）,以pMG36e为载体,电击转化乳酸乳球菌（L.lactis）NZ9800进行表达。对表达产物性质的研究结果表明,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化,其抑菌活性略有下降,但它们的稳定性表现各不相同：N27K/H31K的稳定性与NisinZ几乎一致,而T8S和T2S/H31K的稳定性有明显提高,在pH9条件下100℃加热5min仍不丧失抑菌活性。