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相似文献
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1.
白敏  李崎  邵艳姣  黄元华  李大力  马燕琳 《遗传》2015,37(10):1029-1035
CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制,建立基于CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外,利用HR介导的修复机理,将黄素单加氧酶3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F0小鼠基因测序分析显示,成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠,这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式,成功构建了特定位点突变的小鼠品系。  相似文献   

2.
为在凝血基因IX基因剔除小鼠基础上建立基因组中整合有含特定点突变的人凝血因子IX基因表达载体原转基因小鼠家系,为血友病乙的研究提供更接近临床实际的动物模型。利用体外定点突变技术,构建含有特定点突变的人凝因IX基因表达载体,该载体包括由人凝血因子IX编码区及第一内含子构成的人凝血因子IX基因(hFIXml)、4个拷贝的MCK增强子(MCKe)、鸡β-肌动蛋白启动子(bA)及PolyA,命名为pMe4bAIXml质粒。将其线性化后,用显微注射法注射入817只凝血因子IX基因剔除小鼠受精卵雄原核,再将它们分别回输45只假孕受体母鼠的输卵管中,共产仔69只,存活63只。采用PCR与基因组Southern杂交筛选法鉴定小鼠,证实6只小鼠基因组中整合有含特定点突变的pMe4bAIXml质粒,并对1只小鼠的PCR产物进行测序,证实转基因结构特征符合设计要求。  相似文献   

3.
汪启翰  怀聪  孙瑞林  庄华  陈红岩  费俭  卢大儒 《遗传》2015,37(11):1143-1148
血友病乙是由凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Cas系统,在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点,将Cas9 mRNA和带有靶位点的sgRNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting, HRM)技术进行精确基因分型,并通过测序验证,在60只小鼠中,总共有51只小鼠的靶位点发生了突变,突变率高达85%,其中雄鼠的突变率为79.5%,雌鼠的突变率为95.2%;未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示,突变小鼠的FⅨ活性值(Factor Ⅸ coagulant activity, FⅨ: C)是非突变小鼠的6.82%,大大低于非突变小鼠,表明突变小鼠的凝血活性缺失。本研究表明,利用CRISPR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。  相似文献   

4.
目的 鉴定凝血因子IX基因剔除小鼠。方法 采用PCR扩增检测小鼠的DNA样品以及采用一期法检定小鼠血浆FIX活性和血浆凝血酶原时间 (plasmaprothrombintime ,PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (Kaolinpartialthromboplastintime ,KPTT)值。结果 小鼠PCR检测为阳性 ,FIX活性 <5 %。结论 凝血因子IX基因剔除小鼠能稳定遗传 ,鉴定结果提示该小鼠符合人血友病B相应临床症状。  相似文献   

5.
CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.  相似文献   

6.
藻苔(Takakia lepidozioides)叶绿体基因组中存在着非常高的RNA编辑频率,这种现象至今没有得到很好的解释。本研究采用比较基因组学方法,对小立碗藓(Physcomitrella patens)、青苔(Syntrichia ruralis)和藻苔3种苔藓植物中accD基因的DNA序列和基因编码的蛋白氨基酸序列进行比较分析。研究发现,经过RNA编辑,藻苔的基因产物获得了与其同源基因相同的氨基酸序列。藻苔中高频发生的RNA编辑是对基因组中DNA突变的一种修复,提高了藻苔对强辐射环境的生存适应能力。  相似文献   

7.
adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.  相似文献   

8.
应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)进行基因编辑,为疾病模型的建立、致病机制研究、药物筛选及基因校正治疗疾病提供了更广阔的平台。相对于CRISPR-Cas9介导的基因敲除,应用该系统介导的同源重组实现基因点突变或突变校正效率要低、且难度偏大。为了实现对MYO7A杂合点突变(c.4118C>T)的人iPSCs的点突变校正,本文构建了表达maxGFP的pX330质粒。针对需校正的突变位点,设计5组识别序列并连接到maxGFP-pX330中构建靶向质粒。将5组打靶质粒分别转染HEK 293FT细胞48 h,细胞表达GFP;测序结果显示,MYO7A基因相应位点出现杂峰,表明打靶质粒具有打断活性。将同源模版单链寡核苷酸链(single-stranded DNA oligonucleotides, ssODN)与打靶质粒共同电转入人iPSCs后48 h,经流式分选出(5.8±2.2)%的细胞表达GFP。分选后细胞行单克隆扩增并测序。结果显示,打靶质粒1和ssODN组合对点突变校正未成功;打靶质粒2、3、4、5与ssODN组合均获得了校正后的细胞株。本研究表明,打断位点是影响同源重组校正效率的关键因素。当应用CRISPR/Cas9(或其它核酸酶)介导的同源重组进行基因编辑操作时,可以同时选择多个打靶位点造成基因组不同位置上的双链打断(double-stranded break, DSB)位点,以获得目的单克隆细胞株。本研究为应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞进行基因编辑提供了有力参考。  相似文献   

9.
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。  相似文献   

10.
目的通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础。  相似文献   

11.
血友病B是凝血IX因子(hFIX)缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血IX因子对血友病B治疗具有重要意义。植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势。为此,本研究构建含人凝血IX因子基因(hFIX,2.8kb)植物双元表达载体p35s-2300::gus::noster,用农杆菌介导法转化烟草 "百日红",通过PCR和Southern blot分析证实获得4株独立转基因植株, hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1-4个;RT-PCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5~8.8ng/g·FW,并具有免疫活性。本研究为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考。  相似文献   

12.
基因编辑技术是当今生物学研究领域最为重要的颠覆性技术之一,以CRISPR/Cas9系统为核心的基因编辑工具被广泛应用于包括人类体细胞、生殖细胞编辑相关的医学研究领域。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效编辑靶基因,但其精准编辑能力依赖于效率极低的同源重组方式,这极大限制了其定点编辑的能力与应用范围,所以寻找一种能高效引入点突变的新型基因编辑工具具有重大的应用价值。以CRISPR/Cas9系统为基础的单碱基编辑系统可以在基因组靶位点实现精准、高效的C/G和T/A碱基间的转换,其编辑能力已经在动植物、人体细胞以及人类胚胎中得到证实。利用单碱基编辑技术,有望对人类超过70%的相关遗传性致病位点进行修复。现就人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的最新研究进展进行综述和展望。  相似文献   

13.
[目的]构建新型Red同源重组质粒,对red基因进行分子定向进化,获取高重组效率的red突变基因。[方法]采用PCR的方法扩增不同的功能片断,通过体外同源重组的方法构建Red同源重组质粒pRO38。采用双链重组的实验验证质粒的同源重组功能后,随机突变red基因,通过修复neo缺失突变的方法筛选具有高重组效率的red基因突变质粒库。[结果]构建了长为5 593 bp的pRO38质粒,pRO38质粒具备正常的重组功能,可以有效地将kan-sac B片段插入大肠杆菌染色体。对pRO38中的red基因进行随机突变后,获得了约60个成功修复了neo缺失突变的菌落,而原始的pRO38质粒则无菌落生长。[结论]构建了新型的Red同源重组质粒。通过定向进化的手段,成功获得了高重组效率的red突变基因库,为从根本上提高Red重组效率打下了基础。  相似文献   

14.
构建2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)中国强毒株05ZYH33的sao基因敲除突变株。构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为sao编码基因上下游同源序列的基因敲除载体,同源重组筛选sao基因敲除突变株。PCR、RT-PCR、Western Blot对疑似突变株进行验证,实验结果均证实sao基因完全被spc抗性基因替代,成功构建了突变株05ZYH33-sao。对野生型菌株和突变株进行菌落溶血活性、生长特性、小鼠致病性比较,结果表明sao基因的敲除并未使野生型菌株在以上三方面产生明显的变化。筛选获得的05ZYH33 sao基因突变株为进一步研究sao基因在05ZYH33致病过程中的作用奠定了基础。  相似文献   

15.
基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因打靶小鼠的建立   总被引:9,自引:0,他引:9  
Smads家族是转化生长因子TGF-b信号转导途径中一个重要的新基因家族.SMAD2属于受体激活的SMADs.Smad2基因在多种肿瘤中发生突变,是一种可能的肿瘤抑制基因. Smad2基因完全剔除导致小鼠在胚胎期6.5d死亡.为了研究Smad2在脊椎动物成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,利用Cre/LoxP系统构建了Smad2条件基因打靶载体,将两个方向相同的LoxP序列置于编码SMAD2蛋白C末端功能域序列两侧的内含子中,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能;用打靶载体电击转染小鼠胚胎干细胞,经Southern杂交筛选到3株发生正确同源重组的中靶ES细胞克隆;通过囊胚显微注射将中靶ES细胞导入受体小鼠囊胚腔,获得了ES细胞种系嵌合体;对高嵌合度小鼠与C57BL/6J的子代小鼠进行基因型鉴定,成功地获得了Smad2条件基因打靶小鼠.  相似文献   

16.
基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂(double strand break,DSB)以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式:非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组介导的修复(homology-directed repair,HDR)。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。  相似文献   

17.
目的:建立性激素结合球蛋白(SHBG)基因条件敲除小鼠模型,为探讨胎盘组织中SHBG在体内的生理功能及其与妊娠期糖尿病发病关系提供实验手段。方法:首先运用生物信息学手段确定小鼠SHBG基因组序列,构建SHBG打靶载体,以电穿孔方法将其导入小鼠ES细胞,筛选培养阳性ES细胞并行PCR鉴定,并将正确同源重组的ES细胞注射进小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫;将获得的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配,筛选后获得Flox小鼠,该小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠杂交,子代多次自交获得SHBG全身基因敲除(SHBG~(-/-))的小鼠。结果:运用同源重组及ES细胞技术建立了SHBG基因的Flox小鼠,并利用Cre/Loxp重组酶系统建立了SHBG基因全身敲除小鼠模型,PCR方法从基因水平证明了SHBG基因Flox小鼠及SHBG基因全身敲除小鼠模型建立成功。对基因敲除鼠进行初步表型分析发现:SHBG基因全身敲除小鼠的生长发育与野生型小鼠相比无明显肉眼所见异常,SHBG基因全身敲除雌雄小鼠均具有生殖能力。结论:成功建立SHBG基因全身敲除小鼠模型,通过对基因敲除鼠进行初步表型分析,发现SHBG基因全身敲除小鼠外观上发育正常,为进一步研究SHBG在妊娠期糖尿病中的作用奠定了基础。  相似文献   

18.
采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.  相似文献   

19.
20.
GALT基因突变是人类I型半乳糖血症的主要病因。拟通过CRISPR/cas9系统打靶小鼠Galt基因以模拟人GALT基因突变,从而为建立精准模拟I型半乳糖血症的动物模型奠定基础。首先分析了我国I型半乳糖血症GALT基因的致病突变位点,并将其定位在小鼠Glat基因上,作为小鼠Galt基因的拟突变位点,然后根据拟突变位点区域的序列设计了sgRNA导向序列,构建sgRNA表达质粒,将其与cas9表达质粒共转染小鼠3T3细胞,通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选阳性转染细胞,提取阳性细胞基因组DNA,PCR扩增打靶位点的DNA片段,通过TA克隆测序鉴定基因编辑情况并分析编辑效率。结果表明,3个sgRNA导向序列均可以通过CRISPR/Cas9系统高效编辑小鼠Galt基因,编辑效率为100%。  相似文献   

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