红鳍东方鲀干扰素γ基因的原核表达北大核心CSCD

旨在探究一种简单高效的获取重组红鳍东方鲀IFNγ蛋白的方法。提取红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肾脏组织的总RNA,并以其为模板进行RT-PCR扩增干扰素γ(IFNγ)基因序列。将IFNγ成熟肽序列与表达载体p ET-32a(+)相连,成功构建了重组表达载体PET-32a-IFNγ。将其转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞后获得了重组表达IFNγ的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET-32a-IFNγ在BL21中得到了表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IFNγ基因在大肠杆菌中的表达准确,且目的蛋白表达量较高。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)干扰素调节因子2基因的克隆及原核表达

干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)是一种多功能的转录因子。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了红鳍东方鲀干扰素调节因子2(Interferon regulatory factor 2,IRF2)基因的全长c DNA。该基因全长为1 552 bp,其中5'非编码区(5'-UTR)187 bp,3'非编码区(3'-UTR)429 bp,编码区(CDS)为936 bp,共编码311个氨基酸。将IRF2的编码区序列连接到原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组体p ET32a(+)-IRF2。将重组体p ET32a(+)-IRF2转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,获得了重组表达IRF2的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET32a(+)-IRF2在BL21中得到了融合表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IRF2基因在大肠杆菌中的表达效果较高,目的蛋白准确。     

树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩IFNγ;经金属螯合柱复性及纯化,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IFNγ的分布情况。结果:构建了重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,重组蛋白在30℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h获得较高表达量,镍柱复性纯化后得到较高纯度的树鼩IFNγ。Western印迹显示IFNγ可与兔抗人IFNγ单克隆抗体特异性结合,应用Western印迹和ELISA分别检测树鼩IFNγ的免疫原性和抗体滴度,在树鼩的鼻、心、肝、肺、肾、气管中检测到IFNγ。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IFNγ,复性纯化后具有良好的免疫原性。     

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprⅠ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建并鉴定铜绿假单胞菌(Pa)外膜蛋白OprⅠ重组质粒p GEX-OprⅠ,研究该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法:PCR扩增OprⅠ抗原编码基因并将其定向克隆至原核表达载体p GEX-1λT,构建重组质粒p GEX-OprⅠ;将p GEX-OprⅠ电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析并鉴定表达产物。结果:扩增出194 bp的OprⅠ抗原编码基因;双酶切和PCR鉴定证实OprⅠ基因克隆入p GEX-1λT,并且p GEX-OprⅠ成功转入大肠杆菌BL21(DE3);SDS-PAGE显示重组大肠杆菌BL21(p GEX-OprⅠ)的表达产物为相对分子质量约32 000的GST-OprⅠ融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的20%;Western印迹证实该融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别。结论:构建了重组质粒p GEX-OprⅠ,其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有抗原性的融合蛋白。     

金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白PBPX基因的克隆与表达

[目的]对金黄色葡萄球菌一种新的青霉素结合蛋白(PBPX)进行原核表达,为新型抗菌药物设计提供参考数据。[方法]将ATCC25923基因组数据通过Blast进行比对,从中发现了一个含有PBP保守结构域的基因序列,命名为PBPX。PCR扩增PBPX基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体p ET-32a(+)连接,构建表达PBPX的重组质粒,将该重组质粒转化大肠杆菌TG1内,增菌培养后提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株诱导后进行10%SDS-PAGE分析。[结果]构建了表达载体p ET-32a(+)-PBPX,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达,重组青霉素结合蛋白分子量为52. 2 k Da。[结论]PBPX基因成功克隆到表达载体内并获得了表达。     

不相容双质粒共表达霍乱毒素类似嵌合蛋白

霍乱毒素由5个B亚基(CTB)和l个A亚基(CTA)(包括CTA1和CTA2)组成。该蛋白结构可帮助有毒的CTA1分子进入细胞。本研究拟利用原核不相容双质粒共表达系统获得霍乱毒素类似嵌合蛋白,用于大分子蛋白质黏膜给药的载体研究。将CTB基因片段克隆至载体p ET-28a中,获得重组质粒p ET-28a-CTB;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)代替有毒的CTA1,在CTA2序列N端融合穿膜肽(TAT),将EGFP-CTA2-TAT基因克隆至载体p ET-22b(+)中,获得重组质粒p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT。利用p ET-28a-CTB和p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,将双质粒分步转化到大肠杆菌BL21中。表达条件为0.75 mmol/L IPTG、20℃、200 r/min诱导20 h,重组嵌合蛋白能以可溶形式表达。经过Ni-NTA、Sephadex G-75纯化,Western blotting对蛋白质特异性进行鉴定,确定获得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白。     

骆驼蓬脂转移蛋白基因克隆、表达及体外抗癌活性分析

[目的]构建骆驼蓬脂转移蛋白(Ph LTP)原核表达载体,并研究表达产物的体外抗癌活性。[方法]采用RT-PCR法从骆驼蓬(Peganum harmala)叶中扩增Ph LTP基因,将其成熟肽片段克隆至p ET-30a载体上,构建表达载体p ET-30a-Ph LTP,将重组质粒转化E.coli BL21进行原核表达,通过镍柱纯化获得重组骆驼蓬脂转移蛋白(r Ph LTP),经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,用MTT法检测其体外抗癌活性。[结果]成功构建骆驼蓬脂转移蛋白c DNA表达载体p ET-30a-Ph LTP,其在E.coli中以可溶性融合蛋白形式表达,分子量约为18 k Da。经镍柱纯化后重组蛋白r Ph LTP能够显著抑制宫颈癌He La、黑色素瘤B16和食管癌Eca-109细胞的生长,IC50值分别为16.76±1.23、38.92±2.16和9.01±1.01μg/m L。[结论]克隆了骆驼蓬脂转移蛋白基因并在原核表达系统中成功表达,r Ph LTP所显示的显著抗癌活性预示其具有临床应用的潜能。     

水稻CSN5B蛋白抗血清的制备及其应用

目的:克隆水稻COP9信号复合物5B亚基(CSN5B)的基因,原核表达CSN5B蛋白并制备多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术从日本晴水稻中扩增得到CSN5B蛋白基因Os CSN5B并将其连接至p EASYTM-T5 Zero克隆载体,然后将其亚克隆至原核表达载体p ET-32a+,并导入大肠杆菌BL21plys S宿主菌中诱导表达;重组的CSN5B融合蛋白经Ni-NTA His.Bind Resin纯化后免疫兔子制备多克隆抗体,并经Western印迹分析。结果与结论:获得了CSN5B蛋白的特异性抗体,Western印迹显示CSN5B蛋白在水稻植株中呈高水平表达,为进一步探讨该基因的功能奠定了基础。     

马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因(Dd-Gpx)的克隆与原核表达

旨在研究植物寄生线虫谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的结构和功能,通过RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)Gpx基因,并成功克隆到p ET-41b载体上进行融合表达。结果表明,该基因c NDA全长950 bp,含有1个681 bp的开放阅读框,共编码226个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白N端有明显信号肽,属于分泌蛋白。将其克隆到p ET-41b载体在BL21(DE3)中进行原核表达,结果显示,在60 k D处有一条明显的带。经质谱鉴定,此条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫GPX匹配。表明重组Dd-GPX蛋白表达成功。     

A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。     

稻瘟病菌Dam1基因的克隆、原核表达及纯化

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr)是一种植物病原真菌,可引发水稻的毁灭性病害—稻瘟病,在全世界范围内造成了极大的经济损失。寻找有效防治稻瘟病的方法迫在眉睫。本课题组在前期研究中发现了一种新的稻瘟病菌致病相关基因——Mo Dam1。本研究以稻瘟病菌的RNA反转录得到的c DNA为模板克隆Dam1的ORF,并将其和p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-Dam1,之后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达Dam1重组蛋白,最终纯化后得到Dam1蛋白。     

PPK和GMAS共表达重组菌株的构建及其在L-茶氨酸合成中的应用

构建了共表达ATP再生和L-茶氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌株,并将其应用于L-茶氨酸的合成中。合成多聚磷酸盐激酶(PPK)和γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)基因序列,分别利用p ETDuet-1和p ET-21a(+)载体,构建共表达重组质粒p ETDuet-ppk+gmas和p ET21a-ppk+gmas。将上述两种重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组菌株TPG和APG。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果表明,PPK和GMAS在两种重组菌中均可溶性表达。当用于催化L-茶氨酸合成时,来自APG的GMAS-PPK要优于TPG。利用APG所产的酶进行L-茶氨酸合成,在37℃、p H 7.0条件下,使用催化量ATP可实现L-茶氨酸的摩尔产率为86.0%。该结果一方面扩展了酶法ATP再生系统的应用,另一方面为生物催化合成L-茶氨酸提供了一种有效方法。     

人C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析

构建人C反应蛋白(CRP)原核表达载体,并分别将其转化进入E.coli BL21(DE3)和Rosetta gami 2(DE3)p Lys S中,诱导CRP重组蛋白的表达;主要运用了基因工程,亲和层析及透析复性等方法。成功构建了CRP原核表达载体及菌株。经IPTG诱导后,得到了不同的重组CRP蛋白。结果表明,相同表达载体在不同的表达菌株中的表达情况有一定差别,分别在大肠杆菌及Rosetta gami2(DE3)p Lys S中表达并得到了重组CRP的包涵体,对复性后的CRP重组蛋白进行Westen blotting及ELISA检测,结果表明原核表达的重组CRP蛋白的免疫反应性很低,CRP蛋白发挥免疫活性需要以五聚体形式存在。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110 N端结构特征、原核表达及检测

VP110为对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白。相似性分析发现,VP110与昆虫DNA病毒经口感染关键因子PIF2具同源性,且同源区主要位于N端150~600aa。同时两者均在N端前端含一个跨膜区。为了研究VP110 N端保守区的功能,将vp110 N端基因(Svp110,450~1 830 bp)克隆至p ET-16b及p GEX-4T1原核表达载体中,同时分别在大肠埃希菌BL21(DE3)、Rosetta 2菌株中优化表达条件,诱导VP110 N端蛋白(s VP110)表达。实验结果表明,重组质粒p ET-16b-Svp110在37℃1 mmol/L IPTG条件下可得到表达,但16℃下表达量很低。而重组质粒p GEX-4T1-Svp110则在16℃下得到较高表达。同时,Rosetta 2菌株的表达量高于BL21(DE3)。该研究表明Rosetta 2菌株更适合作为WSSV结构蛋白的表达,同时VP110在不同载体中的表达受温度的影响。VP110 N端蛋白的表达为VP110的功能研究打下了基础。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其活性的鉴定

商品化的乙醛脱氢酶主要从动物细胞、肝细胞线粒体中提取,其来源受到很大的限制,而且价格昂贵。为了解决乙醛脱氢酶原料有限的问题,利用微生物发酵法获取乙醛脱氢酶。将人乙醛脱氢酶2基因(aldh2)克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组载体p ET32a-ALDH2。将构建的重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白得到大量表达;且对诱导表达条件进行优化。结果显示,在37℃,1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h为最优表达条件。由于目的蛋白几乎都是以包涵体形式表达,为了得到有活性的乙醛脱氢酶,对包涵体变性、复性和纯化进行了研究。试验数据显示,酶的最终得率为14.49 U/L。并通过用Bradford法,测定复性蛋白的浓度约为77μg/m L,进行活性检测表明,该复性蛋白具有乙醛脱氢酶活性,酶活性约为1.449 U/m L。通过构建重组载体p ET32a-ALDH2和优化表达条件,aldh2在原核表达宿主E.coli BL21(DE3)得到大量表达;此外,利用透析复性法得到的复性蛋白酶活性有所提高。     

山羊痘病毒p32基因的原核表达及生物信息分析

目的:构建表达山羊痘(GPV)P32蛋白的原核表达载体PTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GPVP32进行生物信息学分析;Primer Primier5.0软件设计引物,在上游引物添加限制性酶切位点SpeⅠ、下游引物添加限制性酶切位点XhoⅠ,以pSK-gpvp32为模板,PCR扩增方法获得基因片段,克隆入PMD18-Simple-T,构建PMD18SimpleT-gpvp32载体,转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞,经酶切筛选、测序确定插入序列的正确,然后将gpvp32克隆入原核表达载体PTYB11中的SpeⅠ、XhoⅠ酶切位点,构建原核表达质粒PTYB11-gpvp32;转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白在不同诱导时间下的表达情况。结果:成功构建山羊痘病毒原核表达载体PTYB11-gpvp32并在大肠杆菌(E.coli)BL21中成功表达GPVP32,经检测重组蛋白表达量约为菌体总蛋白的28%,进化树结果表明山羊痘的亲缘关系与地理位置存在差异及在不同的羊群中进化的结果,经SOSUI等软件综合分析知GPVP32是山羊痘病毒跨膜蛋白的囊膜蛋白但不是信号肽。结论:山羊痘病毒p32基因在大肠杆菌中获得高效表达,为山羊痘病毒的流行性调查、分子生物学研究以及以后有效防治本病提供了物质基础。     

牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达牛γ-干扰素（bovine interferon-γ,BovIFN-γ）,并对其生物活性进行初步鉴定。方法依据GenBank上基因序列人工合成BovIFN-γ基因,PCR方法扩增该基因,将其插入PET-28a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21中,在IPTG诱导下表达BovIFN-γ,并进行Western blot鉴定。Ni-NTA亲和层析法和电洗脱方法纯化表达的重组蛋白,用Western blot和商品化的BovIFN-γ检测试剂盒进行重组蛋白的抗原性检测。结果成功构建了BovIFN-γ原核表达载体PET-28a-BIFN-γ,并在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的32%,表达产物主要以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中;重组蛋白可与BovIFN-γ单克隆抗体反应,Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白抗原活性比电洗脱方法纯化的抗原活性高。结论在大肠杆菌中成功表达了可溶性的BovIFN-γ蛋白,可与BovIFN-γ单抗发生反应,纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。     

基于轻量级卷积神经网络的红鳍东方鲀个体身份无损识别方法

文章充分利用红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)体侧纹理特征提出了一种基于轻量级卷积神经网络的鱼类个体身份识别方法,可在无损前提下实现红鳍东方鲀个体身份的高精度识别。首先,采用SOLOv2模型进行前景分割,并结合红鳍东方鲀体型特点,通过质心和哈希值计算方法完成数据集生成和筛选;随后,从多维度分别测试主流深度学习图像分类骨干网络和不同损失函数在红鳍东方鲀身份识别中的效果;继而,在MobileNet v2骨干网络基础上,耦合Softmax Loss函数,建立了一种适用于红鳍东方鲀的个体身份无损识别的最优组合方法。研究结果表明,文章方法准确率可达90.2%,优于其他相关主流方法(准确率73.6%—89.3%),相关研究成果将为循环水养殖鱼类个体身份无损识别和精准生物量估算提供技术支撑。     

竹黄菌中一个聚酮合酶基因的初步研究

目的:从竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168中扩增出一个聚酮合酶的编码基因g4 PKS,并扩增出其中一段酮基合成酶(KS)基因片段,构建表达载体p ColdⅡ-KS,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。方法:从竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168中提取基因组DNA和总RNA后,采用RT-PCR方法扩增获得目的片段g4 PKS,克隆至p MD18-T进行保存。以T载体为模板,利用引物KSfor/KSrev扩增KS基因片段,构建原核表达载体p ColdⅡ-KS,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结果:成功获得g4 PKS基因;成功构建表达载体p ColdⅡ-KS,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了目的蛋白。结论:成功构建出了表达载体p ColdⅡ-KS,表达出目的蛋白。