一种高效经济的小鼠胰岛细胞分离纯化新技术

目的:建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法,为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件.方法:将5-7周龄、体重20～25 g的雄,陛昆明小鼠的胆总管结扎,并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化,依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞.双硫腙(dithizon,DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞.用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞,培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平,并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激,检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能.结果:每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个,且纯度和活性均大于90%;体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异,至第11天时则明显减少(P＜0.05);应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后,第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P＜0.05),然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低.结论:胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛,且胰岛细胞数量多,分泌状态良好.本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法,同时离体后于5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳,为移植研究的最佳状态.     

胰岛素耐受的HepG2细胞模型建立

采用高胰岛素体外诱导培养HepG2细胞,建立胰岛素耐受的细胞模型。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素培养液中24h,采用3H-D-葡萄糖掺入试验及残余125I-胰岛素结合率测定等方法观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖摄取率及其胰岛素受体数目和功能的影响。高胰岛素诱导培养的HepG2细胞葡萄糖掺入率及残余125I-胰岛素结合率明显低于未用高胰岛素诱导的HepG2细胞(对照细胞)。将高胰岛素诱导培养的HepG2细胞置于不含胰岛素的培养液中60h,其细胞葡萄糖摄取率仍明显低于对照细胞。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素环境中24h,该细胞对胰岛素的生物学效应产生抵抗,其胰岛素抵抗状态可维持60h。     

葡萄糖对体外培养椎间盘髓核细胞的影响

目的:探讨葡萄糖对体外培养髓核细胞的生物学特性的影响。方法:酶消化法分离培养正常椎间盘髓核细胞。对照组:DF12+20%FBS培养液(葡萄糖浓度1000mg/L)、无糖组:无糖DMEM+20%FBS(葡萄糖浓度0mg/L)培养液培养髓核细胞。HE染色观察细胞形态变化,计数板计数细胞总数,台盼蓝染色计算髓核细胞活性比率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst33258染色观察凋亡细胞核的变化。结果:两组培养液培养细胞形态大体正常,并无明显变化。对照组细胞总数明显多于无糖组。细胞活性率对照组也高于无糖组。Hoechst33258染色凋亡细胞,凋亡细胞核内可见致密的颗粒状和块状荧光,细胞核形态不规则,少数细胞核碎裂,部分细胞核呈月牙形。结论:葡萄糖对椎间盘髓核细胞的增殖及凋亡有显著的影响。     

原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:观察高脂负荷在胰岛素抵抗形成中的意义.方法:用不同浓度椋榈酸、胰岛素分别培养骨骼肌细胞2h、6h、12h、24h,对棕榈酸诱导组的一部分细胞给予1× 10-7M胰岛素刺激2h,用血糖检测试剂盒(GOD-POD)检测各组培养液中的葡萄糖含量,研究不同浓度棕榈酸、胰岛素对骨骼肌细胞摄取葡萄糖的影响,观察胰岛素的生理功效的变化.结果:0.6mM棕榈酸诱导12h以上或者5×101-M胰岛素诱导24h后,培养液中的葡萄糖浓度比正常组高且有显著性差异,表明细胞的糖代谢能力降低.经1×10-7M胰岛素刺激2h后的棕榈酸诱导组,培养液中葡萄糖的浓度与未经胰岛素刺激的棕榈酸诱导组相比无显著差异,胰岛素的生理功效降低,证实棕榈酸诱导组细胞已对胰岛素产生耐受.结论:高脂或高胰岛素条件均可诱导原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型.     

组织灌流与贴壁法体外培养奶牛乳腺组织的比较研究

采用组织灌流和组织块贴壁法体外培养奶牛乳腺组织,通过LDH活力测定、台盼蓝染色、琼脂糖凝胶电泳、透射电镜技术比较两种培养方法对奶牛乳腺组织活性及组织超微结构的影响,建立奶牛乳腺组织的培养体系。结果表明,以1mL/h的速度灌流培养的奶牛乳腺组织在DMEM 10%小牛血清培养基中12～60h内保持良好的组织活性和超微结构,贴壁培养的奶牛乳腺组织在DMEM 10%小牛血清的培养基中60～108h内保持良好的组织活性和超微结构,两种培养方法各有优缺点。     

胰岛素对β细胞FoxO1胞质-胞核穿梭定位的影响

目的:通过激光扫描共聚焦显微镜对小鼠胰岛素瘤min6细胞免疫化学染色后观察外源性高胰岛素对Fox O1胞质-胞核穿梭定位的影响。方法:小鼠胰岛素瘤min6细胞用DMEM(low glucose)培养基(含有15%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素)于25 m L培养瓶放置在37℃、5%CO2浓度的细胞孵箱中培养。细胞爬片后给予100μIU/m L浓度胰岛素分别刺激12、24和48小时。细胞免疫化学染色后激光扫描共聚焦显微镜观察Fox O1的表达位置变化,用Image pro plus软件对Fox O1荧光强度进行半定量分析。结果:与低糖孵育的对照组相比,胰岛素孵育12 h、24 h和48 h时胞质内Fox O1荧光强度逐渐增强,而细胞核Fox O1荧光强度减弱(P0.05)。结论:高浓度胰岛素孵育min6细胞使Fox O1出细胞核转位至细胞质,并且具有时间依赖性,提示Fox O1是高胰岛素血症对β细胞功能影响的机制之一。     

沉默长链非编码RNA Meg3损伤小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌功能

MEG3是一种长链非编码RNA。已有研究证明,鼠源Meg3参与小鼠诱导多能干细胞、神经元和视网膜的分化过程。最新报道,MEG3在人胰岛β细胞中高表达,但其对维持成年胰岛β细胞的功能尚不清楚。本研究旨在探讨Meg3在小鼠胰岛细胞胰岛素分泌功能中的作用。实时定量PCR揭示,与Balb/c小鼠心、肝、脾、肺、肌、肾等组织/器官比较,Meg3在胰腺组织中高表达。在非糖尿病小鼠发生自发性糖尿病的第8、12周,Meg3在胰岛中的表达水平分别下调24%±8%和29%±9% (P<0.01);而当血糖升高20 mmol/L,小鼠胰岛中Meg3表达下调72%±16%(P<0.01)。在MIN6细胞中采用RNA干扰敲减Meg3的表达,在高糖浓度（20 mmol/L）刺激条件下,胰岛素分泌显著减少。小鼠静脉注射siRNA,结合血糖测定或葡萄糖耐受试验（IPGTT）显示,si-Meg3小鼠血清胰岛素水平显著下降。注射葡萄糖前血糖升高,注射葡萄糖后耐受能力降低;免疫组化分析显示,si-Meg3小鼠胰岛素阳性细胞的面积减少。实验结果提示,Meg3通过参与胰岛素的合成和分泌维持成年小鼠胰岛功能。Meg3表达失调可能参与I型糖尿病（T1DM）发病过程。     

大鼠骨骼肌卫星细胞诱导分化为胰岛素生成细胞的研究

目的探讨大鼠骨骼肌卫星细胞（MDSCs）定向诱导分化为胰岛素生成细胞（IPCs）,为1型糖尿病的干细胞治疗提供一种新的研究思路。 方法通过二次酶消化法和差速贴壁培养法分离、培养大鼠MDSCs,利用不同的诱导培养液使MDSCs定向分化为IPCs,并对诱导后细胞进行形态观察,通过双硫腙染色和免疫组化染色对MDSCs-IPCs形态进行鉴定,采用Q-PCR和Western Blot方法检测MDSCs-IPCs中C-peptide和Insulin的表达,通过胰岛素释放实验检测MDSCs-IPCs的生物学功能,β细胞和MDSCs-IPCs两组间比较采用t检验。 结果MDSCs在接种4 h后开始贴壁部分细胞伸出小的突起,48 h后绝大多数细胞贴壁呈梭形、胞浆丰富、折光度高。随着培养时间的延长,细胞的梭形形状更为明显且生长迅速。免疫组化结果显示细胞表达Desmin、α-Sarcomeric Actinin、MyoD1、Myf5和PAX7。成胰诱导后MDSCs形成胰岛样的圆形细胞团,双硫腙染色呈猩红色,Insulin免疫组化染色阳性。Q-PCR结果显示MDSCs-IPCs中C-peptide和Insulin mRNA表达量分别是β细胞的0.73倍（P > 0.05）和0.79倍（P > 0.05）。胰岛素释放实验显示,5.6 mmol/L和16.7 nmlol/L葡萄糖刺激培养2 h后,β细胞和MDSCs-IPCs分泌胰岛素量分别为[（20.3±4.2）mU/L]、[（16.1±3.7）mU/L]、[（60.5±9.3）mU/L]和[（40.9±7.3）mU/L],葡萄糖可调节MDSCs-IPCs胰岛素的分泌。 结论MDSCs易于分离培养、增殖能力强,体外可诱导分化为有功能的IPCs,适合作为再生医学的种子细胞。     

INS-1E细胞葡萄糖毒性模型的建立

目的:建立胰岛细胞系INS-1E细胞的葡萄糖毒性模型。方法:将INS-1E细胞分别在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L、16.7mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)的1640完全培养基中培养不同时间(48 h、72 h、96 h、120 h),分别在不同时间点取细胞进行细胞功能检测,实时荧光定量PCR法检测胰岛素m RNA的表达,ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素的分泌。结果:与对照组相比,高糖浓度(5.5 mmol/L、16.7 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)培养基中培养48 h后,INS-1E细胞的胰岛素合成和分泌的功能均增加(P均0.05),随着培养基中葡萄糖浓度的升高以及培养时间的延长,INS-1E细胞胰岛素合成及分泌的功能逐渐下降,当在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养基中培养120 h后,胰岛素m RNA合成及葡萄糖刺激的胰岛素分泌均显著降低(P均0.01)。结论:INS-1E细胞在30 m M的葡萄糖中培养120 h形成稳定的葡萄糖毒性模型。     

青龙木制剂对小鼠胰腺β细胞单位电活动的影响

目的:观察青龙木制剂(Ambyna preparation)对小鼠胰岛β细胞单位放电的影响,探讨青龙木制剂促进胰岛素分泌的机制.方法:以大于刺激阁以上(＞5mmol/L)的葡萄糖滴注在体小鼠胰腺上诱发胰岛β细胞电活动,用玻璃微电极记录在体小鼠胰岛β细胞的单位放电.结果:青龙木制剂和格列本脲一样加强葡萄糖诱导的胰岛β细胞电活动.结论:青龙木制剂加强葡萄糖诱导的胰岛β细胞电活动进而促进胰岛素的分泌.     

不同浓度葡萄糖对β-TC3 细胞Gα表达的影响

目的:研究不同浓度葡萄糖对β-TC3(小鼠胰岛β细胞瘤细胞)细胞Gα(G蛋白α亚基)表达的影响。方法:β-TC3细胞在正常葡萄糖浓度下(11.1 mM)适应性生长两天后,将细胞暴露于不同葡萄糖浓度(25、50 mM),分别于24、48、96h收集细胞,并行蛋白质印迹检测Gα的表达。结果:加入葡萄糖后24、48、96h,Gα的表达明显下降(相对对照组)。结论:持续高糖刺激,可导致β-TC3细胞Gα表达的下调,从而影响细胞信号转导,致使胰岛素抵抗的发生。     

L-丙氨酸对小鼠胰岛分泌胰岛素的急性作用及其葡萄糖依赖性研究

探讨L-丙氨酸刺激小鼠胰岛分泌胰岛素的剂量和葡萄糖依赖性。雌性6~10周NMRI小鼠,苯巴比妥腹腔麻醉,应用胶原酶技术消化胰腺分离胰岛,置于RPMI1640培养皿中在37℃培养箱(5%CO2,95%空气)过夜培养。次日在Krebs-Ringer缓冲液中37℃水浴培养箱预培养30 min,分别把单个胰岛小心放入100 L含有不同浓度葡萄糖和不同浓度L-丙氨酸的改良Krebs-Ringer缓冲液37℃水浴培养箱培养60 min,留取50 L上清液进行胰岛素测定。结果:L-丙氨酸在0.1~20mmol.L-1范围促进了葡萄糖刺激的小鼠胰岛的胰岛素分泌,随剂量增大而增强,在低浓度葡萄糖存在的条件下,10 mmol.L-1L-丙氨酸不能刺激小鼠胰岛的胰岛素分泌,在6.7 mmol.L-1及以上葡萄糖存在的条件下,L-丙氨酸能增加葡萄糖诱导的小鼠胰岛分泌胰岛素。本研究显示L-丙氨酸能增加葡萄糖诱导的小鼠胰岛分泌胰岛素,此作用依赖于一定水平葡萄糖的存在。     

胰岛素对beta细胞FoxO1 胞质-胞核穿梭定位的影响

目的：通过激光扫描共聚焦显微镜对小鼠胰岛素瘤min6 细胞免疫化学染色后观察外源性高胰岛素对FoxO1 胞质- 胞核穿 梭定位的影响。方法：小鼠胰岛素瘤min6 细胞用DMEM( low glucose )培养基（含有15%FBS 、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉 素）于25 mL培养瓶放置在37 ℃、5%CO2浓度的细胞孵箱中培养。细胞爬片后给予100 uIU/mL 浓度胰岛素分别刺激12、24 和 48 小时。细胞免疫化学染色后激光扫描共聚焦显微镜观察FoxO1 的表达位置变化,用Image pro plus 软件对FoxO1 荧光强度进 行半定量分析。结果：与低糖孵育的对照组相比,胰岛素孵育12 h、24 h和48 h时胞质内FoxO1 荧光强度逐渐增强,而细胞核 FoxO1 荧光强度减弱（P＜0.05）。结论：高浓度胰岛素孵育min6细胞使FoxO1 出细胞核转位至细胞质,并且具有时间依赖性,提 示FoxO1是高胰岛素血症对beta细胞功能影响的机制之一。     

生长抑素可预防链佐霉素诱发的大鼠胰岛 B 细胞分泌功能的损伤

本工作通过测定大鼠血清、胰腺灌流液以及肤腺组织中胰岛素含量,观察生长抑素(SS)对链佐霉素(STZ)诱发的实验性糖尿病的作用。结果如下:皮下注射生理盐水后10min,再向腹腔注射链佐霉素(35mg/kg),24h 后大鼠血清胰岛素浓度明显降低。胰腺组织匀浆中的胰岛素含量也明显减少。如若在注射链佐霉素前10min 皮下注射生长抑素,则可有效地防止上述两项指标的改变,(NS STZ)和(SS STZ)两组之间具有显著差异。单独注射生长抑素,24h 后血清胰岛素及胰腺组织中胰岛素含量与正常对照无明显差异。用分离的大鼠胰腺作体外灌流,观察到:NS STZ 组大鼠灌流胰腺对19.7mmol/L 的高浓度葡萄糖刺激无胰岛素释放反应,而 SS STZ 组大鼠的胰腺对高浓度葡萄糖有反应性,刺激后出现胰岛素分泌峰。上述结果表明,SS(30μg/kg)预防性注射可以防止 STZ 引起的胰岛 B 细胞分泌功能的障碍。     

胶原酶消化法分离制备罗非鱼和中华鳖的胰岛细胞及其生物活性

目的探讨罗非鱼、中华鳖胰岛细胞分离提取的方法及对比两者的生物学活性差异。方法采用胶原酶消化分离罗非鱼、中华鳖胰岛细胞,光镜下观察其形态结构。在体外用不同浓度的葡萄糖刺激胰岛细胞,测定其生物学活性。结果罗非鱼、中华鳖胰岛细胞在体外对不同浓度的葡萄糖刺激具有明确的生物学反应,并随着葡萄糖浓度的增加胰岛素的产生也相应增加。结论采用胶原酶消化分离罗非鱼、中华鳖胰岛细胞的方法可行,胰岛细胞在体外对不同浓度的葡萄糖刺激产生胰岛素并具有正相关,其为鱼纲、爬行纲与哺乳纲动物之间的胰岛细胞移植奠定了实验基础。     

有机铬对实验性糖尿病大鼠胰岛β细胞形态结构及功能的影响

目的探讨有机铬(2-吡啶甲酸铬)对大鼠胰岛β细胞形态结构及内分泌功能的影响。方法首先通过尾静脉注射新鲜配制的1.5%四氧嘧啶溶液制备糖尿病大鼠模型;通过灌胃的方式提高糖尿病大鼠体内有机铬含量;治疗12周后,通过氧化酶法测定大鼠血清葡萄糖水平,利用免疫组织化学方法和放射免疫学方法分别观察大鼠胰岛β细胞形态结构的改变及大鼠血清胰岛素含量的变化。结果两治疗组大鼠血清葡萄糖水平明显下降,与糖尿病模型组相比,差异均有显著性;400μg治疗组大鼠体内胰岛素水平明显升高,与糖尿病模型组相比差异有显著性,而200μg治疗组大鼠血清胰岛素水平虽有所增加但与糖尿病组相比,差异无显著性;免疫组化显示治疗组大鼠胰岛β细胞数量增多,胞质内胰岛素免疫反应阳性颗粒明显增多。结论有机铬对糖尿病大鼠具有明显的降低血糖功能,并能促进受损胰岛及β细胞形态结构功能的恢复,对糖尿病大鼠病理状态具有明显的改善作用。     

新生猪胰岛保存运输的实验研究

探索新生猪胰岛较长时间有效保存运输的方法,使不同胰岛应用单位间分享胰岛资源成为可能.用胶原酶消化、分离得到新生猪胰岛,培养5 d后收集,将所得胰岛置于自行设计制作的保存运输系统内,分别于置入后2、4、5、7 h,分次取出胰岛进行双硫腙(DTZ)染色、吖啶橙荧光染色、体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,确定胰岛细胞的功能和活性,并使用流式细胞仪检测凋亡情况.使用本研究的保存运输方法,在5 h以内,胰岛的功能和活性无明显受损,超过5 h,胰岛明显凋亡,功能、活性显著降低.在脱离培养箱环境情况下,本方法5 h内可以有效保存胰岛.     

柯萨奇B4病毒在体外对小鼠胰岛素分泌功能的影响

柯萨奇B4病毒（CB4V）感染被认为和胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）的发病有关。我们对体外培养的小巴胰岛和胰岛细胞经CB4V感染后,检测其胰岛素分泌功能。结果显示,病毒感染组的胰岛包膜的消失较对照组早;糖刺激的胰岛素释放量明显低于对照组,但CB4V并不引起胰岛细胞的溶解。这表明：（1）CB4V可在体外感染小鼠胰岛和胰岛细胞。（2）CB4V可损害胰岛β－细胞合成胰岛素的功能。     

枸杞多糖对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛细胞的保护作用

报道了枸杞多糖(Lb-PS)对4mmol／L四氧嘧啶(AXN)损伤的离体培养的大鼠胰岛细胞的保护作用。实验分为正常对照素、AXN损伤组和Lb-PS保护组。采用放射免疫分析法测定胰岛细胞内胰岛素水平以及葡萄糖刺激的胰岛素释放水平。分光光度比色法测定细胞内SOD和葡萄糖激酶的活性,以及培养基中NO和MDA的含量。结果表明,AXN显著抑制细胞内的胰岛素合成和葡萄糖刺激的胰岛素释放,以及SOD和葡萄糖激酶的活性。AXN促使培养基中N0和MDA浓度的显著增加。在同时加入AxN和105～102mg／ml Lb—PS的实验组中,均发现能不同程度地保护胰岛细胞免受AXN的损伤。Lb-PS能恢复AXN损伤的胰岛细胞的胰岛素合成和释放水平,以及SOD和葡萄糖激酶的活性,使其基本达到正常对照组的水平。Lb-PS还能降低培养基中NO和MDA的浓度。因此,Lb-PS可能通过减少胰岛β细胞的NO产量和维持SOD和葡萄糖激酶的活性,最终起到保护胰岛素合成和释放功能的作用。     

联合应用大鼠血管内皮细胞和胰岛培养对胰岛功能的影响

目的 探讨通过体外共培养胰岛和血管内皮细胞能否改善胰岛的功能.方法 SD 大鼠分离纯化出胰岛细胞,分为两组:A 组胰岛单纯培养组,B 组胰岛和内皮细胞共培养组.从大鼠的胸主动脉分离纯化出血管内皮细胞,胰岛分离纯化后通过AO/PI 染色和胰岛素释放实验来判断两组胰岛的活性.结果 共培养组胰岛在7 d 内维持正常的形态,9...