嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

目的:克隆嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶(Ahp)基因,进一步分析序列、预测三级结构。方法:设计Ahp基因特异性引物,利用PCR方法扩增基因序列,亚克隆至pMD18-T载体,进行DNA测序及生物信息学分析。结果:获得Ahp基因大小为1 645bp,推导编码548aa,含有天冬氨酸(82-93aa)、组氨酸(123-133aa)和丝氨酸活性位点(342-352aa)。Ahp蛋白三级结构与模板(PDB:3HJR_A)相似性达81.48%,预测60-392aa区域为肽酶S8结构域(PF00082)、480-548aa区域为前蛋白转化酶P结构域(PF01483),其中3个氨基酸活性位点分布于三级结构N端,与拉马钱德兰图检测分析Ahp蛋白的空间结构基本一致。结论:该研究对嗜水气单胞菌Zf1菌株Ahp基因编码蛋白进行结构预测,有助于理解嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶的作用机理。     

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因的克隆与序列分析

根据嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)转录调控蛋白(AhyR)基因序列设计特异性引物,采用PCR方法克隆嗜水气单胞菌Zf1菌株AhyR基因,测序目的基因大小为1 063 bp。对AhyR基因编码蛋白进行生物信息学分析,推导其开放阅读框(ORF)编码260 aa,含有自体诱导物结合域(18-168 aa)、LuxR型螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合结构域(176-241 aa),以及13个磷酸化位点(15S、30T、62S、144S、145S、156S、161Y、173S、184T、188T、200S、227S、231Y)。AhyR蛋白三级结构与模板(PDB:3SZT_A)相似性达28.40%,结果显示LuxR型螺旋-转角-螺旋结构域主要以α螺旋分布在C端外侧,这与拉马钱德兰图(Ramach andran plot)检测分析AhyR蛋白空间结构基本一致。     

嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。       

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

嗜水气单胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达及免疫原性分析

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的外膜蛋白基因(OmpTS)和溶血素基因(Hly)是其重要的保护性抗原。根据Genbank已发表的两个基因的序列设计引物,扩增其去除信号肽部分的基因片段,再将二者通过柔性片段融合,定向插入到质粒pET32a中构建重组融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得与预期大小108 kD相吻合的融合蛋白条带。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。ELISA和Western Blot检测该抗体效价为1∶4000以上,且该重组蛋白与抗OmpTS兔血清和抗Hly兔血清都呈阳性反应,表明该融合蛋白保留了外膜蛋白和溶血素的免疫原性,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性.基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要.目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少.[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因...     

诸氏鲻虾虎鱼出血病病原鉴定及传播途径分析

目的分离鉴定诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)出血病病原,并探讨其传播途径,为虾虎鱼微生物质量控制提供技术依据。方法从患出血病虾虎鱼肝脏取样分离病原菌,经菌落形态、生化特性和分子特征鉴定细菌,回归感染确定其致病性,并采用双重PCR方法对虾虎鱼、轮虫、卤虫、水进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)检测。结果分离到1株优势菌PYMc15-1,该菌株API生化反应结果与嗜水气单胞菌一致,gry B序列与Gen Bank上的嗜水气单胞菌相应基因序列同源性最高;根据已知序列构建gry B分子系统进化树,分离株PYMc15-1与嗜水气单胞菌聚类;分离株PYMc15-1溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)检测结果阳性,对虾虎鱼半致死剂量(median lethal dose,LD_(50))为每尾1. 2×104cfu。野生虾虎鱼、卤虫和野生轮虫致病性嗜水气单胞菌检测出现阳性结果,虾虎鱼封闭群、室内培育的轮虫以及海水样品致病性嗜水气单胞菌检测均为阴性。结论嗜水气单胞菌可自然感染虾虎鱼;野生虾虎鱼和生物饵料是其潜在传播媒介,引进虾虎鱼和生物饵料时应检测该病原。     

嗜水气单胞菌HBNUAh01 外膜蛋白A 基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达

【目的】从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)HBNUAh01中克隆外膜蛋白A(outer membrane proteinA,ompA)基因并在烟草(Nicotiana tabacum)叶片细胞中瞬时表达该蛋白。【方法】以嗜水气单胞菌HBNUAh01为模板进行嗜水气单胞菌外膜蛋白A(AhompA)基因片段的PCR扩增,并将其克隆到pEASY-Blunt Simple载体中以进行测序。测序正确的AhompA基因序列与含有黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein,YFP)基因的表达载体pCAMBIA1300构建重组表达载体。将该重组表达载体转化到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受态细胞中,随后用阳性转化子转染烟草叶片细胞。使用激光扫描共聚焦成像系统(Confocal Laser Scanning Microscope)检测观察融合表达AhompA基因的黄色荧光蛋白并采用RT-PCR检测AhompA基因在烟草叶片中的转录情况。【结果】从嗜水气单胞菌HBNUAh01中克隆出大小为1032 bp的AhompA基因序列,并在烟草叶片中成功表达AhompA和YFP的融合蛋白。【结论】AhompA基因在烟草叶片细胞中的成功表达为进一步研究利用植物疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病奠定了基础。     

聚合酶链反应(PCR)法检测产β-溶血素嗜水气单胞菌

嗜水气单胞菌(A.hydrophila Stanier下略为Ah)隶属弧菌科气单胞菌属,分布广泛,是鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类的致病菌。一般认为Ah的致病机理与其产生的毒素密切相关,尤其是溶血素1-5。作者推测采用PCR法检测β-溶血素基因也能用于确认鱼类的致病菌株。本文根据鱼源Ah卜溶血素基因序列设计了两对引物,用Nested-PCR法证实了我国鱼源Ah流行株亦存在卜溶血素的基因后,探讨了应用PCR法检测产卜溶血素Ah的方法及其灵敏度。       

和厚朴酚对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为了研究不同浓度和厚朴酚对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)致病力的影响, 筛选抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物, 通过溶血试验、免疫印记试验、荧光定量PCR试验和动物试验进行了研究。结果发现, 和厚朴酚能在亚抑菌浓度下降低嗜水气单胞菌培养物上清中的溶血活性; 蛋白免疫印迹试验发现和厚朴酚能降低嗜水气单胞菌气溶素的分泌; 荧光定量PCR试验进一步表明和厚朴酚与嗜水气单胞菌共培养后降低了气溶素编码基因aerA的转录而降低气溶素的分泌。此外, 通过动物试验发现和厚朴酚治疗能显著提高斑点叉尾鮰( Ictalurus punctatus )嗜水气单胞菌感染模型的存活率。以上研究表明, 和厚朴酚能通过降低气溶素编码基因aerA的转录而降低嗜水气单胞菌的致病力, 和厚朴酚是一种潜在的新型抗嗜水气单胞菌感染的先导化合物。     

嗜水气单胞菌侵袭力与宿主细胞信号转导和骨架的关系

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是淡水鱼暴发性败血症的主要病原,该菌能够引致淡水鱼等的败血症和人的腹泻等^[1]。嗜水气单胞菌有多种致病因子,如毒素、蛋白酶、S层蛋白等^[2],还发现它具有侵袭作用,有报道嗜水气单胞菌粪分离株能侵袭HEp-2细胞^[3],但对于鱼源菌株的侵袭特性知之甚少。仅有一些报道认为嗜水气单胞菌能引致细胞病变^[4,5]。     

CP7抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理

[目的]研究多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理,为防治嗜水气单胞菌引起的鱼病提供新的潜在天然药物.[方法]采用抑菌试验、钼锑抗比色法和紫外光谱法研究其对嗜水气单胞菌S12菌株生长、磷泄漏和生物大分子的影响,并利用扫描电镜和透射电镜观察了嗜水气单胞菌细胞结构遭受的破坏作用.[结果]CP7ACP对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径约8.1 mm,最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)分别为原液浓度的1/8和1/4;嗜水气单胞菌受CP7ACP处理后,电镜观察发现其细胞壁、细胞膜、细胞器以及菌体均受到不同程度的破坏,胞内的生物大分子和磷泄漏明显,基因组DNA发生增色效应.[结论]CP7ACP抑制嗜水气单胞菌生长,可用于防治嗜水气单胞菌引起的鱼病.     

人赖氨酸乙酰基转移酶7结构域蛋白的原核表达及纯化

目的:克隆人赖氨酸乙酰基转移酶7(KAT7)的2个功能结构域基因,获得其原核表达产物,并纯化蛋白。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人KAT7基因的2个功能结构域(1-330aa)和(331-611aa)编码片段,将其克隆到p ET28a载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中分别扩增获得约990和840 bp的DNA片段,并克隆至p ET28a载体,测序结果表明与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别约为42 000和36 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa)。结论:获得了重组蛋白KAT7(1-330aa)和(331-611aa),为后续研究KAT7与肿瘤调控奠定了实验基础。     

单增李斯特菌溶血素O的PEST序列激活ERK1/2磷酸化的作用

[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的关键结构域PEST序列(包含S44、S48和T51关键磷酸化位点)突变体,并针对其生物学功能展开研究。[方法]以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因,克隆至pET30a(+)原核表达载体,在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒,转入E.coli Rosetta感受态细胞中,诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性,并通过Western blotting检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。[结果]结果显示,本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH5.5和7.4条件下,LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性,说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现,重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。[结论]研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需,且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。     

新城疫病毒P/V/W基因编码产物功能结构域的分析及定位

NDV的P基因能够通过RNA编辑机制编码3种病毒蛋白P、V和W。为了初步确定新城疫病毒P、V和W的功能结构域及其在P基因中位置,对这3种具有相同N端不同C端的病毒蛋白进行生物信息学分析。分别设计针对基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ型以及class Ⅰ NDV毒株P基因的引物。RT-PCR获得5种基因型NDV P基因的正确序列。通过核苷酸序列预测P基因表达产物的氨基酸序列,并进行二级结构预测和三级结构模拟。将SV5 V蛋白空间结构作为模板,从而分析获得了NDVP/V/W基因编码产物的二级结构以及部分空间结构。综合各种分析数据,预测P蛋白辅助N蛋白折叠的结构域位于N端前50 aa内;介导P蛋白四聚体形成的coiled-coil结构位于221-290 aa范围内;介导P蛋白与基因组的作用的X结构域位于291-392 aa范围内。V蛋白的C端结构域的编码区域位于P蛋白132-239 aa编码区域内。     

海洋真菌灰绿曲霉地标蛋白编码基因AgTeaA的克隆与序列分析

为考察灰绿曲霉中地标蛋白AgTeaA对菌丝极化生长的作用,首先需要获得AgTeaA基因序列的相关信息.通过简并PCR的方法得到AgTeaA基因编码区的一段序列,以已知序列为基础通过染色体步移的方法获得基因全长及两端侧翼序列,然后通过逆转录PCR的方法确定出氨基酸序列,并利用相关生物学软件进行蛋白结构域的分析和系统进化树的构建.结果显示,AgTeaA基因编码区全长4 706 bp,对应氨基酸全长为l 477 aa,在256-320 bp,733-780bp,1 064-1 150 bp处各有一个内含子.与粟酒裂殖酵母Teal蛋白和构巢曲霉TeaA蛋白相似的是,AgTeaA在290-339aa,340-390 aa处各有一个Kelch结构域,在818-899aa,938-999aa,1 021-1 116aa,1 183-1 335aa处各有一个卷曲螺旋(coiled coil)结构域.     

一种检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的四重PCR法

建立一种快速诊断致病性嗜水气单胞菌的PCR法。根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、外膜蛋白、溶血素及丝氨酸蛋白酶基因设计4对引物,经PCR反应条件优化后进行检测。结果表明,仅嗜水气单胞菌呈阳性,其检测敏感性高,可检测100 fg的DNA模板。20株大鲵源嗜水气单胞菌经四重PCR法检测时,有18株呈阳性。其中,毒力基因种类较多的阳性菌株经人工感染试验和胞外产物活性检测时显示出较高的致病性。利用该PCR法进行的其他检测中,还发现33份人工感染样本全部呈阳性,34份疑似样本有21份呈阳性,说明四重PCR法可应用于临床检测。本研究建立的四重PCR法具有高度敏感性和特异性,可用于嗜水气单胞菌快速诊断。     

乙型肝炎病毒逆转录酶区基因序列准种与变异特点

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)P基因编码产物从功能上分为末端蛋白(1～178aa)、间隔区(179～336aa)、逆转录酶区(337～682aa)和RNA酶H区(683～816aa),各区有相应的生物学功能;逆转录酶区包含S基因主蛋白编码区.近年来的研究提出HBV感染者体内存在有准种[1,2]的假说.我们以逆转录酶区序列为研究靶区域,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶基因序列,随机选择克隆测序,比较其结果,证明了HBV准种特点的存在,并发现多种基因突变形式.     

霍乱弧菌和副溶血弧菌分离株的gyrB基因系统发育分析

依据gyrB基因部分编码序列构建系统发育树以分类和鉴别霍乱弧菌和副溶血弧菌,并探讨其种系发生关系。扩增并测序13株霍乱弧菌、8株副溶血弧菌、2株嗜水气单胞菌及1株类志贺邻单胞菌的gyrB基因(编码DNA促旋酶B亚单位)序列,并采用距离法与最大似然法构建系统发育树。两种方法所构建的树结构完全一致,霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌及类志贺邻单胞菌各自形成一个独立的簇。其中,霍乱肠毒素基因(ctxA)阳性的霍乱弧菌(8株O139群与2株O1群ElTor型)聚类成一分枝;3株副溶血弧菌临床株(1株2002年流行株,2株2004年分离株)与1日本菌株及2001年1株自环境分离的毒力株聚类。系统发育分析靶分子gyrB基因可以良好区分上述4种常见病原菌。产毒O139群霍乱弧菌与产毒O1群ElTor型霍乱弧菌关系密切。副溶血弧菌环境毒力株与本地区临床主要流行株在系统发育关系上较为接近,可能是潜在的致病菌。     

编码嗜麦芽黄单胞菌terminase-like蛋白基因的克隆与分析

根据Grover报道的XanthomonasmaltophiliaCG类受体的 342bp核酸序列设计的一特异引物P2和随机引物进行PCR扩增 ,将约 75 0bpPCR产物克隆到 pUCm T载体上 ,得到重组质粒 pUCm Ter。pUCm Ter上插入片段经M 13通用引物双向测序 ,其中ORF5 5 5核酸序列的 2 83～ 36 2bp部分与PseudomonasphageD3orf2基因的 1385～ 14 6 4bp部分有 86 %相同碱基。由ORF5 5 5编码 184aa蛋白序列的 1～ 16 5aa部分与PseudomonasphageD3orf2基因编码terminase的 2 2 9～ 393aa部分具有 6 6 %相同序列。因此 ,克隆到的ORF5 5 5核酸序列可能是编码嗜麦芽黄单胞菌terminase like蛋白的基因序列。