增殖分化视角下成年哺乳动物心肌再生研究进展

心肌再生是逆转心肌损伤和心力衰竭的理想途径，也是心血管医学领域的研究重点。传统观点认为成年哺乳动物心肌细胞无法自我更新和再生，然而最近研究报道心肌细胞能以微弱比例内源再生。通过调节心肌再生过程或调控关键分子表达，可以诱导具有收缩功能的心肌细胞出现，改善损伤心脏的结构和功能。近年心肌再生研究大多侧重细胞增殖，对心肌细胞去分化、增殖及再分化的全过程关注较少。因此，该文从增殖分化视角综述成年哺乳动物心肌再生的诱导方式，旨在探讨实现成年哺乳动物心肌细胞大规模自我更新的可能性。     

微重力条件下心肌细胞在聚羟基乙酸纤维支架上的三维固定化培养

以 1d龄Wistar乳鼠的心室肌组织为心肌细胞的来源 ,采用胰蛋白酶消化及细胞差速贴壁分离心肌细胞 ,以未经修饰和经鼠尾胶原溶液浸泡修饰的聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)纤维支架作为心肌细胞体外三维 (3D)固定化培养的支架 ,比较心肌细胞在静置培养体系及微重力培养体系下的生长、形态和收缩状况。心肌细胞在未经处理的PGA纤维支架 3D固定化培养时 ,心肌细胞在其上的分布不均匀 ,大部分心肌相互连接形成球状聚集体 ;PGA纤维支架经鼠尾胶原溶液浸泡处理后 ,心肌细胞在其上的分布较为均匀 ,细胞形态多呈梭形或不规则状 ,心肌细胞自律性搏动的幅度加大。在模拟微重力培养条件下 ,心肌细胞在经鼠尾胶原溶液浸泡修饰的PGA纤维支架上的分布更为均匀 ,心肌细胞形成具有自律性同步收缩特性、面积约为 15mm2 的类组织样 3D结构     

高原低氧环境对心肌细胞影响的研究进展

青藏高原是世界上海拔最高, 面积最大的高原, 有其独特的地理环境, 具有温度低、湿度低、温差大、强紫外线辐射和低压低氧等特点; 而心脏是高耗能耗氧的器官, 对缺氧十分敏感。心肌细胞是研究心肌结构功能代谢病理生理机制的重要工具, 故心肌细胞培养技术备受关注。同时近年来中藏药对心肌细胞的保护研究成为热点。文章主要从高原环境对心肌细胞的影响及心肌细胞的培养和保护方面进行综述。     

可视化动缘探测系统检测心肌细胞舒缩功能

目的:分离成年大鼠心室肌细胞,利用可视化动缘探测系统检测其收缩/舒张功能.方法:常规酶解法分离制备钙耐受心肌细胞;用Ca2 荧光探剂fura-2/AM(0.5μmol/L)负载心肌细胞30 min(25℃)后,以含氧台氏液灌流并予电场刺激(0.5 Hz,5 ms),采用动缘探测系统检测心肌细胞收缩/舒张功能及细胞内荧光信号变化.结果:可视化动缘探测系统可实时同步观察和记录心肌细胞机械功能和细胞内钙瞬变变化,并可计算得到细胞收缩/舒张和钙瞬变的变化幅度、时程及速率等一系列指标,从而直接反映细胞水平的心肌功能改变.结论:可视化动缘探测系统为人们提供了一个在单心肌细胞水平探讨心肌肌源性功能及其改变的新方法,是当今心血管研究的一项重要技术.     

未成熟心肌保护研究的进展

未成熟心肌与成熟心肌在结构、生化、功能、能量代谢以及对缺务氧耐受性方面存在着明显的差异^[1]。但是目前尚无理想的并被广泛接受的未成熟心肌保护方法^[1,2]。由于小儿心脏外科的发展趋向幼小、复杂、危重,有些危重病儿（如完全性大动脉转位）甚至在新生儿期即施行手术,主动脉阻断时间也相应延长,但由于未成熟心肌保护技术不能相应跟上,术后心功能不良,这已成为婴儿特别是新生儿开心术后死亡的重要原因之一。本文对缺血预处理（ischemic preconditioning,IP）及K^ 通道开放剂（potassium channel openers,PCOs）、脂肪酸代谢和肉碱的未成熟心肌保护作用等进行综述,以期有助于未成熟心肌保护技术的进一步提高。     

跳动心肌细胞微型培养模型的建立及应用

自Harary最初报告了培养的心肌细胞能够继续跳动以来,跳动心肌细胞培养模型已被广泛应用于心肌功能、代谢及结构的研究,并取得了不少成绩。跳动心肌细胞培养还可用于检测血清或其制品中是否存在影响心肌收缩、代谢或具有心肌毒性物质。我国中医研究院西苑医院基础研究室应用此模型进行中药     

小剂量过氧化氢对大鼠心肌细胞钙瞬变及凋亡的作用

目的:探讨小剂量过氧化氢导致的氧化应激对大鼠心肌细胞钙瞬变及细胞凋亡的作用。方法:解剖取出成年大鼠心脏,应用langendorff方法分离心肌细胞,加入fluo-3荧光指示剂后,应用不同浓度的过氧化氢作用于心肌细胞,在共聚焦显微镜下测定心肌细胞内钙瞬变。分离并培养新生大鼠心肌细胞,观察过氧化氢处理心肌细胞后其形态的变化,从而评价小剂量过氧化氢对心肌细胞的凋亡作用。结果:应用0.125 mmol/L、0.25 mmol/L及0.375 mmol/L的过氧化氢作用于心肌细胞后,心肌细胞内钙瞬变幅度明显升高,并呈时间剂量依赖性。在培养的大鼠原代心肌细胞中加入0.25 mmol/L的过氧化氢后,心肌细胞发生凋亡的形态变化。结论:小剂量过氧化氢可开放心肌细胞L-钙通道,明显增加心肌细胞内钙瞬变,并导致心肌细胞凋亡。     

心肌细胞增殖影响因素和评价方法

大量心肌细胞丢失是心肌梗死后进展为心力衰竭和临床死亡的主要原因.近年来的研究证明,成年哺乳动物心肌具有一定的再生能力,但该能力十分有限而不足以修复受损的心脏组织,因此促进内源性心肌再生是未来治疗心肌梗死的重要方向.原有心肌细胞的增殖是内源性心肌再生的主要来源,因而探索心肌细胞增殖的调控机制,寻找促进心肌细胞增殖的干预措施成为心肌再生研究领域的热点,并取得显著进展.同时,成年心肌细胞具有可多倍体化、多核化但难以胞质分裂等特点,导致评估心肌增殖的方法成为难题,精确量化心肌增殖的各种模型和体系不断被开发.本文回顾总结了心肌再生的基本方式、心肌细胞增殖影响因素和评估方法,探讨了当前内源性心肌再生研究领域的进展和挑战.     

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况。方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞,评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin)治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率。结果在每个成年小鼠心脏分离了40~60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞。心肌细胞培养1 h2、4 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究。     

模拟微重力条件下心肌细胞的体外三维固定化培养

观察心肌细胞体外培养形成三维(3D)组织结构的能力和过程及心肌细胞在模拟微重力状态下的3D固定化培养效果。应用酶消化法从新生的乳鼠心室肌组织获取心肌细胞,以Cytodex3为心肌细胞的3D固定化培养载体,将心肌细胞固定化培养于Spinnerflask中,用扫描电镜观察心肌细胞体外培养形成的3D组织结构;以心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度为观察指标,比较心肌细胞在Spinnerflask及HARV(highaspectratevessel)生物反应器中3D固定化培养的差异。结果显示,心肌细胞不仅能贴附于Cytodex3上生长,且形成了具有同步自律收缩的3D组织样结构;心肌细胞在两种不同培养体系中的细胞接种效率和细胞形态没有明显差异,培养于HARV中的心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度均明显高于Spinnerflask培养体系。体外培养的乳鼠心肌细胞具有形成同步自律收缩的3D组织结构的能力;模拟微重力的培养环境有利于改善心肌细胞3D组织样培养物的代谢和功能 。     

成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征

目的：比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。方法 Langendorff装置进行主动脉逆流灌流,分别用两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,无血清培养并进行腺病毒感染。显微镜下观察单个心肌细胞的形态学特点,荧光显微镜下检测病毒感染。采用IonOptix仪器检测心肌细胞肌节收缩-舒张指标以及心肌细胞钙离子摄入-排出指标。结果两种分离液均可获得70％横纹清晰的长杆状心肌细胞,培养可存活7 d以上。腺病毒感染48 h,绿色荧光蛋白持续表达7 d以上。分离液一获得的心肌细胞不能很好地随电场刺激产生收缩,分离液二获得的细胞可用于检测兴奋-收缩耦联特性,心肌细胞肌节缩短分数为11.61％±2.15％,舒张时间为（0.177±0.031） s,钙瞬变幅度为30.79％±9.74％,钙瞬变衰减时间为（0.300±0.074） s。结论两种分离液均可用于分离和培养成年大鼠心肌细胞,并用于腺病毒转染等长时程研究。分离液二更适用于检测成年大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联特性。     

调控人多能干细胞来源心肌样细胞分化成熟的信号通路及其相关化合物研究进展

由人多能干细胞分化而来的心肌细胞具备良好的基础研究与临床治疗前景,但其结构与功能的不成熟限制了其发展。功能化合物可以直接作用于人多能干细胞向心肌细胞分化成熟过程中的信号通路。添加功能化合物是一种简单、有效、可重复性好的方法。许多团队在促进人多能干细胞向心肌分化成熟的信号通路与功能化合物研究方面取得了实质性的科研进展,该文针对这两方面作出综述,以期为后续实验提供指导。     

利用细胞化学染色方法辨别体外培养的心肌细胞

在一般的心肌细胞培养物中含有相当数量的非心肌细胞,故应用培养的心肌细胞进行研究,需要辨别培养物中的心肌细胞与非心肌细胞,我们试图用细胞化学染色方法结合活细胞观察及H.E染色的细胞形态学观察对乳鼠心肌培养物中的心肌细胞进行鉴别。     

研究报告：MWNTs/PMMA薄膜对大鼠棕色脂肪来源的心脏干细胞生物学特性的影响

近年来,鉴于心肌组织独有的电生理特性,应用导电纳米材料作为细胞支架开展心肌组织工程研究取得明显进展．碳纳米管材料具有良好的力学性能和导电特性,前期研究表明,其具有促进新生鼠心肌细胞中未成熟心肌细胞增殖与成熟心肌细胞进一步发育的作用,但尚未见碳纳米管材料对棕色脂肪来源的心脏干细胞(CSCs)生物学特性影响的研究报道．为此,本研究首先采用凝胶-溶胶法制备了羧基化多壁碳纳米管和聚甲基丙烯酸甲酯 (MWNTs/PMMA)薄膜,并通过一系列细胞学、免疫细胞化学及电镜检测方法,系统评价了MWNTs/PMMA薄膜对大鼠棕色脂肪CSCs活力、增殖能力及向心肌分化效率的影响．研究发现,与明胶材料相比,MWNTs/PMMA薄膜对棕色脂肪CSCs活力、增殖能力有明显促进作用,并且明显增强其向心肌细胞分化的能力,分化的心肌细胞具有明显可见的肌管结构,并且表达介导细胞间电化学传导的缝隙连接蛋白connexin43．此外,超微结构观察发现碳纳米管与细胞膜间及细胞与细胞之间可直接形成紧密连接,调控细胞行为．本研究首次探讨了碳纳米管导电材料对棕色脂肪CSCs生物学特性影响的规律,证实碳纳米管导电材料具有良好的促心肌细胞分化作用．作为一种新型导电纳米材料,碳纳米管在心肌组织工程研究中具有良好的应用前景,未来有望在心肌组织体外构建及心肌梗死治疗性应用中发挥潜在的价值．     

电生理法评价培养心肌细胞的功能

心脏学研究已经跨入分子和细胞水平,国外进展迅速。培养的心肌细胞是从微观上研究心肌结构、功能、代谢和发育不可缺少的实验材料。 培养心肌细胞用途是:1。研究离子通道的行为与特征。膜片记录单离子通道电流是近十年来生理学研究的最新领域,从分子水平阐明膜及受体的功能,培养的心肌细胞是主要的实     

初生与成年牦牛心肌的组织学结构比较

为探究牦牛心肌发育过程中组织学结构的变化,采用组织学、组织化学和免疫组织化学方法对初生和成年牦牛心肌的组织学结构、心钠素（ANP）和缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达情况进行了观察。结果显示,初生牦牛心肌细胞数量少且细短,闰盘为直线型或V型,心肌细胞间以Ⅲ型胶原纤维为主,Ⅰ型胶原纤维较少;成年牦牛心肌细胞粗长,其数量是初生牦牛的2倍,闰盘呈竹节样吻合或阶梯状,心肌细胞间以Ⅰ型胶原纤维为主。初生和成年牦牛,ANP在心房肌细胞中均表达强烈,且右心房表达量显著高于左心房,心室肌细胞中不表达。ANP在普肯耶纤维中有少量表达。初生牦牛心房肌细胞ANP表达量高于成年牦牛。在心肌细胞膜和胞质内,初生牦牛Cx43表达强于成年牦牛,但在闰盘内,成年牦牛Cx43表达强于初生牦牛。Cx43在初生和成年牦牛的普肯耶纤维中均呈膜阳性。结果提示,初生与成年牦牛相比,成年牦牛的心肌细胞变粗长且数量增多,ANP在心房肌表达减弱,Cx43在闰盘表达更显著,说明成年牦牛较初生牦牛适应循环变化的代偿能力呈进行性减弱;细胞间牢固性增加,有助于实现心肌收缩信号的迅速传导。     

大鼠,豚鼠心肌细胞的简单,快速分离

本文介绍了一种简单、快速分离成年大鼠、豚鼠心肌细胞的方法。所分得的细胞形态结构完整,具有良好的钙耐受性,膜片钳上易于形成高阻抗接封,因而适于作各种电生理记录。     

犬心肌细胞分离方法的改良

目的:建立高效可靠的成年犬心肌细胞分离方法,获得高产量与高质量的心肌细胞,以便进行犬心肌细胞收缩功能的研究.方法:采用改良的Langendorff灌流胶原酶消化法分离得到左心室心肌细胞.荧光显微镜观察细胞生长状态和形态并利用单细胞收缩动态边缘检测系统测定心肌细胞收缩功能的改变.结果:结果显示,与传统方法相比,即刻分离的心肌细胞状态良好,复钙后的心肌细胞成活率达到70％-80％,转染重组腺病毒β2-EGFP培养48 h,心肌细胞成活率为60％-70％.给予持续电场刺激,心肌细胞可以保持收缩节律和幅度稳定30 min以上.结论:该方法操作简单,分离的活细胞产量高,质量好,节约实验成本和时间,为心血管相关研究提供良好的细胞模型.     

发育心肌和心肌干细胞分化后心肌特异蛋白表达的比较研究

为探讨MCSC移植修复缺血性心肌的可能性,观察了大鼠发育心肌和MCSC分化为心肌细胞的cTnT和Cx-43表达特点。结果表明从胚胎发育至成年,心肌cTnT mRNA表达逐渐上调;用BMP-2诱导1周的MCSC可检测到cTnT mRNA表达,3～4周表达显著升高,诱导2周能观察到cTnT蛋白,3～4周可见cTnT呈现横纹样结构。胚胎第11 d心肌可检测到Cx-43 mRNA表达,生后7 d达高峰,以后逐渐降低,17 d趋于稳定。胚胎期Cx-43蛋白多分布于肌膜下,生后10 d位于细胞连接处。诱导的MCSC中Cx-43 mRNA表达特征与cTnT mRNA相似,2周可观察到Cx-43蛋白,3～4周可见Cx-43位于相邻细胞连接处。本研究结果提示,在BMP-2诱导下MCSC可分化为心肌细胞,表现为成熟心肌细胞的结构特征。MCSC有望成为治疗缺血性心脏病的理想种子细胞。     

大鼠心肌重塑过程中Axin蛋白质的表达变化

为观察大鼠心肌重塑过程中Axin蛋白质表达水平的变化,实验用颈静脉输注去甲肾上腺素(NE)和动静脉造瘘(AVF)方法复制大鼠心肌重塑病理模型,采用超声心动术检测心脏结构和收缩功能。取病理模型大鼠左心室以及分离培养的成年大鼠心肌成纤维细胞,采用Wester blot技术检测Axin蛋白质的表达水平。结果观察到,在颈静脉输注NE 3d后,大鼠心脏发生向心性心肌肥厚和心肌纤维化,其左心室的Axin蛋白表达水平较对照组显著升高。A-V造瘘术一周后引起大鼠离心性心肌肥厚,心肌无明显纤维化,心肌Axin表达量与对照相比无显著变化。在分离培养的成年大鼠心肌成纤维细胞,NE处理24h能明显升高Axin蛋白的表达水平。上述结果表明,大鼠心脏有Axin蛋白质表达,NE致大鼠心肌重塑过程中Axin蛋白表达显著增加,可能与该过程的心肌纤维化有关。